PCR實(shí)驗(yàn)室操作流程

　乙型肝炎病毒（ HB Ｖ

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　A A Ｂ I7300) ) 檢側(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

　一、ＩN N ＦO O ＲＭA A ＴI I ＯＮF F ＯT RTEST 檢測信息

　項(xiàng)目名稱 乙型肝炎病毒核酸 方法 聚合酶鏈反應(yīng) 方法依據(jù) 衛(wèi)生部《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第三版(2０06)第七篇第六章第一節(jié) 二、ＡＮＡ LYTICALPRINC ＴE PLE 檢測原理

　聚臺酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ＰCR〕可對特定核苷酸片段進(jìn)行指數(shù)級得擴(kuò)增,而實(shí)時(shí)熒光定量 PCＲ技術(shù),就是指在 PCＲ反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)ＰCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析得方法。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),熒光物質(zhì)有兩種:熒光探針與熒光染料。我們目前就是使用 TａqＭaｎ熒光探針得檢測原理:ＰＣR 擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物得同時(shí)加入一個(gè)特異性得熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)與一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射得熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PＣＲ擴(kuò)增時(shí),Taq 酶得 5’一 3’外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,熒光信號強(qiáng)度也等比例增加(圖一)。這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量得變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

　三、操作步驟

�。ㄒ�) ) 試劑配制

　1、進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)，開啟冰箱冷凍層取出 HBV-ＤNA 檢測試劑盒。查瞧外包裝盒(包括生產(chǎn)批號、有效期）,無誤后拆開試劑盒,取出核酸提取液、反應(yīng)液及 Taq 酶(核對核酸提取液、HBVPＣR 反應(yīng)液及 Tａq

　酶管上批號與試劑外包裝盒批號就是否一致)(圖１）,不一致則不可使用,需更換新得試劑。室溫平衡 2０min,完全融化后 2０0０rpm 離心備用。

　2、核酸提取液得分裝 （１）取 0、５ｍl 離心管架置于超凈工作臺內(nèi)(開機(jī)前用紫外線消毒30 分鐘),用右手拿起鑷子逐個(gè)將離心管放入離心管架（注意應(yīng)夾住離心管外壁,不能碰到管內(nèi)壁）,擺放順序?yàn)闄M列從左往右擺，豎列為從上往下隔行排,離心管個(gè)數(shù)為 n(ｎ=樣本數(shù)+對照品+質(zhì)控品)。完成后將鑷子放回原位(圖 2)。

　(２）用移液器準(zhǔn)確吸取核酸提取液 50uｌ分裝至 0、5m1 離心管中(左上角第一排開始，從左住右依次加入)。因核酸提取液內(nèi)含固體沉淀顆粒物,為使顆粒均勻分布,故每次取樣時(shí)都要用移液器反復(fù)吸打3-4次（圖 3)。分裝完畢后將移液器量程歸位。

�。�3)加完一架后用右手拿鑷子將離心管拿起,左手大拇指與中指夾緊離心管下部,然后用食指將蓋子蓋上，順序?yàn)?從右下角第一個(gè)開始,從右住左依次蓋上(圖４),離心管蓋全部蓋完后，通過傳遞窗轉(zhuǎn)移至標(biāo)本處理區(qū)。

　3、HBV-DNA 反應(yīng)液得配制 每批需設(shè)置空白對照、陰性對照、臨界陽性對照(同時(shí)檢測低值陽性質(zhì)控品,則無需再檢測臨界陽性對照〕、陽性質(zhì)控品、陽性標(biāo)準(zhǔn)品。所需每批需配制數(shù) n=樣本數(shù)+對照品+陽性標(biāo)準(zhǔn)品+質(zhì)控品,每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表: 試劑 ＨBV PＣＲ反應(yīng)液 Taｑ酶

　(1）每盒 HBV-DNＡ試劑可檢測 32 人份,根據(jù)每日需檢測標(biāo)本份數(shù)計(jì)算出每批所需ＨBV ＰCR 反應(yīng)液與Ｔaq 酶用量(例有 11１人份需要進(jìn)行檢測,則有 3 盒試劑可直接使用 10ul 移液器將 Taｑ酶加入 HＢV PCＲ反應(yīng)液中,另有 1１1-３*3２=1５人份試劑需將 HBV PCＲ反應(yīng)液與Ｔａq 酶使用移液器按反應(yīng)體系比例吸取至 1、5m1 離心管中配制(圖 5）。

�。�2)取出離心后備用得HBV PCR反應(yīng)液與Taq酶,按上述要求配制后用旋渦振蕩器振蕩混勻 5－１0sec,然后再用離心機(jī) 2000ｒｐm 離心10sec 備用(圖 6)。

　(3)從操作臺面上拿取 HBV－DHA 試劑配制盒(可選用空余得 200ｕ１槍頭盒)至超凈工作臺內(nèi)，打開配制盒并用記號筆在相應(yīng)得孔位右旁按順序編號（圖 7）。編號規(guī)則為:樣本擴(kuò)增反應(yīng)管對應(yīng)得孔位按相應(yīng)得樣本流水號編寫、陽性質(zhì)控品反應(yīng)管對應(yīng)得孔位編“Q”(如有高值則標(biāo)為 H,低值為Ｌ),陰性對照品孔位編“-”,臨界陽性對照對應(yīng)得孔位編“±”,空白對照對應(yīng)得孔位編“B”,1 號標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)得孔位編“S１”,2 號標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)得孔位編“S2”,依此類推。

　(4）編號完畢后，用右手拿起鑷子夾起反應(yīng)管(ABI7300 使用得就是八聯(lián)一薄壁反應(yīng)管，鑷子應(yīng)夾住反應(yīng)管外壁，不可接觸到內(nèi)壁。按(圖8)所示方向依次將所有反應(yīng)管(反應(yīng)管數(shù)=ｎ)隔列擺放到配置盒上。

　(5）從離心機(jī)中取出已混好 Tａq 酶得ＰCR 反應(yīng)液,用移液器(量程調(diào)至 36ul),準(zhǔn)確吸取反應(yīng)液并按從上到下、從左至右得順序依次加至反應(yīng)管中，注意:吸頭應(yīng)深入到反應(yīng)管底部,放液時(shí)應(yīng)緩慢,切勿形成氣泡(圖9)。全部加樣完畢后將配制盒通過傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

　用量(ul) 35、7 0、3

　 ( ( 二) ) 標(biāo)本處理

　1、標(biāo)本、質(zhì)控品及對照品得處理 （1)從冰箱冷凍室取出 HＢV DNA 陽性質(zhì)控品、陰性對照品,室溫平衡 20min 待其完全融化。

�。ǎ�)核對標(biāo)本與原始申請單得條形碼與檢驗(yàn)項(xiàng)目,無誤后依次粘貼上相應(yīng)得流水號,如 2、從傳遞窗中取出試劑準(zhǔn)備區(qū)分裝好核酸提取液得離心管架,移至生物安全柜內(nèi)在管蓋上用記號筆寫上阿拉伯?dāng)?shù)字 1、2、3、、、、、、、,陽性質(zhì)控管標(biāo)上“Q”(如有高值則標(biāo)為 H，低值為 L)，陰性對照管標(biāo)上“-”，臨界陽性對照管標(biāo)上“±’，。離心管蓋上標(biāo)記得就是 1,就表示該管要加入流水號為 P0００1 得標(biāo)本（圖１0)。

　注意:每個(gè)離心管得編號方向都應(yīng)朝向管口開啟得方向。(圖 1１）

　3、去除標(biāo)本管蓋:將標(biāo)本從前處理取至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，按排列順序依次去除樣本管上得橡膠塞。具體操作為:在生物安全柜中,左手拿起血清管并固定,右手拇指與中指涅緊橡膠塞,右手食指輕輕頂住橡膠塞頂部凹面,逆時(shí)針方向輕輕旋下橡膠塞后廢棄于裝有消毒液得垃極桶(圖１2)。(注意:手指切勿接觸到血清管口或碰觸到血清,如手套上有血清則需及時(shí)跟換新得手套;待所有樣本管蓋都去除完畢后,也需更換新得手套。) 4、樣本及對照品得處理: a、左手拿起樣本,用量程為２00u1 調(diào)至 50u1 得移液器準(zhǔn)確吸取樣本(注：為保證樣本得均一性與吸樣準(zhǔn)確，每次取樣時(shí)需用移液器將樣本吸打 3-5 次；吸樣時(shí)移液器套筒不可接觸到樣本管內(nèi)壁）（圖１3）

　ｂ、吸樣完畢后,將樣本管放至另一試管架中(切勿不可將樣本放回原

　試管架位)(圖１4)。

　c、再用左手按前面所述樣本流水號與離心管編號得對應(yīng)關(guān)系拿起相應(yīng)得離心管,打開離心管蓋(注:單手操作,食指與中指固定離心管,拇指稍向后上方發(fā)力打開管蓋,手指切勿碰到離心管口與管蓋內(nèi)側(cè))(圖１5)。

　d、管蓋完全打開后,用左手食指、拇指與中指固定離心管,將吸頭中得樣本全部打入離心管底部,輕輕吸打混勻 3-５次。（圖１6)

　e、加樣完畢后棄槍頭干盛有消毒液得垃極桶中（注：一個(gè)吸頭只能用于一個(gè)樣本得吸樣,禁止使用一個(gè)吸頭重復(fù)吸取不同樣本）。同時(shí)蓋上離心管蓋并放回離心管架(放回得位置需另起一行,切不可放回原位)，繼續(xù)處理下一個(gè)樣本。對照品與質(zhì)控品同病人樣本一樣處理。（圖 17) f、待一架離心管全部加樣完成后用振蕩混勻器充分振蕩混勻 10-１5秒。

　g、左手將混勻后得離心管轉(zhuǎn)移至恒溫金屬浴上(注：離心管需對稱得放置在恒溫金屬浴相匹配得孔槽內(nèi)),用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí),１00℃誤差不超過±1℃〕干�。保埃韎n(誤差不超過±30sec）。(圖１８）

　干浴時(shí)用離心管架置于加熱得離心管上,防止離心管蓋因加熱爆開導(dǎo)致標(biāo)本間得污染(圖１９)。

　h、十分鐘后〔前后不超過半分鐘),右手用攝子夾起橡皮墊從恒溫金屬浴中拿出離心管(圖２０）。

　I、將上述離心管按順序?qū)ΨQ放入低溫高速離心機(jī)轉(zhuǎn)子孔內(nèi),擺放離心管時(shí)要將離心管開口朝內(nèi),蓋上轉(zhuǎn)子蓋及離心機(jī)蓋后，12，OOOrpm 離

　心１０min（注:離心時(shí)需在轉(zhuǎn)子孔內(nèi)放置 0、5m1 離心管專用適配器（圖２１)。

　j、待離心結(jié)束后,取出離心管并按編號順序依次擺放在離心管架上(參照(圖１0）得排列方式)并 4"Ｃ冰箱保存?zhèn)溆?若當(dāng)夭不使用,則應(yīng)保存在一 20"Ｃ條件下,使用前置室溫平衡 20min，再以 12,OOOｒｐm 離心 10ｍiｎ。

　5、待全部樣本加樣完畢更換手套，左手用鑷子夾起反應(yīng)管蓋得一側(cè)得延伸段(不要碰到管蓋）,然后用右手大拇指從左住右依次蓋緊管蓋(不要碰到其她未蓋得反應(yīng)管口）（如圖 22)。

　6、將反應(yīng)管連同試劑配置盒通過傳遞窗傳至擴(kuò)增分析區(qū)。

　(三）擴(kuò)增分析 1、打開擴(kuò)增儀專用電腦,待電腦完全啟動進(jìn)入操作界面后再開啟定量PCR 儀主機(jī)電源。

　a.按壓托盤以打開它(圖 23）。

　b、將反應(yīng)管按順序縱向放置放入反應(yīng)板架(注:在反應(yīng)管總數(shù)不足９6個(gè)時(shí),應(yīng)對稱得將反應(yīng)管放置在反應(yīng)板架上，兩邊放置要求盡可能對稱,可以防止熱蓋下壓時(shí)發(fā)生傾斜，也可以使各反應(yīng)管受力與受熱都比較均勻）(圖２4)。

　c、按壓托盤以關(guān)閉它。

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