微生物室sop文件

　目錄

　第一篇

　細(xì)菌室操作程序文件

　 1. 細(xì)菌室人員崗位職責(zé)……………………………………………………..1 2. 標(biāo)本采集及保存要求………………………………………………………3 3. 顯微鏡檢查法操作規(guī)程……………………………………………………5 4. 細(xì)菌室標(biāo)本操作流程………………………………………………………6 5. 細(xì)菌的形態(tài)檢查操作規(guī)程…………………………………………………8 6. 細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定及其它實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程………………………………11 7. 細(xì)菌的接種與培養(yǎng)方法操作規(guī)程………………………………………17 8. 支原體培養(yǎng)、鑒定及藥敏操作規(guī)程……………………………19 9. 血液感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程…………………………………………20 10. 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程………………………………22 11. 下呼吸道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程……………………………………24 12. 尿路感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程…………………………………………26 13. 消化道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程………………………………………29 14. 膿汁及病灶分泌物細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)程………………………………31 15. 生殖系統(tǒng)標(biāo)本的處理……………………………………………………33 16. 抗菌藥物敏感試驗(yàn)………………………………………………………34

　第二篇

　醫(yī)院微生物感染控制檢測

　17. 消毒滅菌效果監(jiān)測……………………………………………………….37 18. 環(huán)境衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測………………………………………………………….38 19. 采樣及檢查原則…………………….………….………………………..39 20. 各部位的消毒…………………………………………………………….43

　細(xì)菌室人員崗位職責(zé)

　 1、上班后先搞好室內(nèi)衛(wèi)生、核查各個培養(yǎng)箱、冰箱的工作溫度是否在設(shè)定的范圍內(nèi)，并做好記錄。檢查各種儀器工作是否正常，做好記錄。

　2、接收樣本：核對各樣本號與申請單聯(lián)號是否一致，如不一致馬上與病房聯(lián)系以便作出相應(yīng)的處理，如退單或重送樣本等，并做好聯(lián)系情況的記錄。核查各送檢樣本是否符合要求。

�、� 痰液樣本：先看外觀、再直接涂片鏡檢，以白細(xì)胞≥25 個/低倍鏡視野，而上皮細(xì)胞≤10 個/低倍鏡視野，為合格痰液。

�、� 無菌體液樣本：檢查各種無菌體液樣本的盛放器皿是否符合要求。

�、� 容易干燥的樣本：對一些容易干燥的樣本如大便、咽拭子、膿液拭子、泌尿生殖道拭子等是否已經(jīng)干燥。

　對不符合要求的樣本必需與臨床聯(lián)系，以便作出相應(yīng)處理，方法如聯(lián)號不符的樣本，做好記錄。對符合的樣本進(jìn)行原始單的登記。

　3、樣本編號：對符合的樣本作出編號，普通細(xì)菌培養(yǎng)：痰液、咽拭子、血液增菌培養(yǎng)、尿液、胸、腹水、腦脊液、膽汁、膿液、泌尿生殖道拭子、大便致病菌培養(yǎng)。在各種培養(yǎng)基上及申請單上編號的同時均需明確標(biāo)明接種日期。

　4、樣本接種：

�、� 血液、骨髓、腹水、關(guān)節(jié)液等：增菌培養(yǎng)瓶； ② 痰液、咽拭子：血平板、麥康凱平板； ③ 尿液：血平板、麥康凱平板； ④ 大便致病菌：SS 平板； ⑤ 腦脊液：血平板、巧克力平板； ⑥ 分泌物的淋球菌培養(yǎng)接種：淋球菌專用平板； ⑦ 支原體培養(yǎng)+藥敏：按說明書接種支原體專用培養(yǎng)基。

　對以上接種樣本的當(dāng)前編號應(yīng)記錄于登記本上。此外對痰、膿液、腦脊液等在接種的同時應(yīng)對其沉渣進(jìn)行革蘭染色，如有細(xì)菌和或何種細(xì)菌為主立刻通知臨床，并做好記錄。

　5、查對昨天移種平板申請單及原始登記本，確定標(biāo)本移種是否正確。觀察

　血液增菌培養(yǎng)瓶，如發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長，馬上涂片革蘭染色，將細(xì)菌的染色特性及形態(tài)報告給臨床，并做好記錄，同時進(jìn)行移種。

　6、觀察平板，挑取可疑菌落涂片革蘭染色，并做好細(xì)菌的鑒定與藥敏實(shí)驗(yàn)工作。

　7、檢查各種培養(yǎng)基及試劑的庫存量，做好需配制培養(yǎng)基或購買試劑的交班工作。

　8、定期做好本室所用鑒定和藥敏試條的質(zhì)控，做好記錄。

　9、每天必須消毒平板、基礎(chǔ)培養(yǎng)基等用于常規(guī)醫(yī)院感染監(jiān)測，另外根據(jù)具體情況即時準(zhǔn)備好各種中和劑、無菌瓶等，對 48 小時的空氣培養(yǎng)出報告，同時注意是否有致病菌、菌落數(shù)是否超標(biāo)。

　10、工作完成后注意對工作臺面進(jìn)行消毒、室內(nèi)進(jìn)行消毒。

　標(biāo)本采集及保存要求

　1、總則：用于細(xì)菌培養(yǎng)的標(biāo)本在收集時應(yīng)注意嚴(yán)格無菌操作和及時送檢，檢測后標(biāo)本應(yīng)妥善保存。

　2、臨床標(biāo)本的采集 2.1、下呼吸道分泌物(痰液) 令患者早上起床后用清水瀨口，不要刷牙，立即從下部呼吸道咳出第一口痰，吐在無菌塑料痰盒中，及時送檢。

　2.2、尿液(中段尿) 護(hù)理人員協(xié)助采取中段尿約 3ml 入無菌塑料盒中，及時送檢。

　2.3、糞便 取有粘液、膿血部分的糞便置無菌塑料盒中及時送檢。

　2.4、眼、耳、鼻、喉拭子 將棉拭子沾取少許無菌生理鹽水(如沾取的太多，可在無菌生理鹽水瓶壁上擠去多余的水份)，然后采取可疑部位的分泌物，倒懸于無菌塑料盒中，及時送檢。

　2.5、膿液 用沾有生理鹽水的棉拭子沾取膿液，要盡量多取一些，然后將棉拭置于無菌塑料盒中，及時送檢。

　2.6、血液 2.6.1、凡懷疑菌血癥和敗血病的患者，采血培養(yǎng)時，應(yīng)盡量在未使用抗菌素前采血，如已使用抗菌素，應(yīng)盡量選擇抗菌素在體內(nèi)濃度最低時采血，應(yīng)在病人第二次使用抗菌素之前采集血培養(yǎng)標(biāo)本。當(dāng)然在病人發(fā)熱或寒顫時采集也可。

　2.6.2、成人每次采血 5～10m1，小兒采血 3～5ml。

　2.6.3、嚴(yán)格消毒病人采血部位和血培養(yǎng)瓶口，抽一定量血液后，無菌注入血培養(yǎng)瓶內(nèi)，輕輕搖勻。

　2.6.4、從抽血到接種入瓶，動作要快，防止血液凝固，同時要及時送檢。

　2.7、穿刺液

　胸腹水、心包液、關(guān)節(jié)腔液、鞘膜積液，嚴(yán)格無菌抽取后，注入含肝素抗凝的無菌試管中，輕輕顛倒試管 10 余次，使肝素與穿刺液混勻達(dá)到抗凝的目的，或直接無菌注入血培養(yǎng)瓶內(nèi)及時送檢。

　2.8、膽汁 由�？漆t(yī)生以無菌方法取引流液 10m1 注入無菌塑料盒內(nèi)。

　2.9、腦脊液 以無菌方法取腦脊液 3～5ml，置無菌試管內(nèi)，常溫保存送檢，如只做培養(yǎng)可直接無菌注入血培養(yǎng)瓶內(nèi)，及時送檢。

　2.10、生殖器官標(biāo)本 陰道、子宮頸及前列腺等分泌物應(yīng)由醫(yī)師采集，收集于無菌塑料盒內(nèi)送檢。

　如疑為淋病奈瑟菌感染，做培養(yǎng)檢查時，采集的標(biāo)本應(yīng)床旁接種并及時放入孵箱培養(yǎng)。

　2.11、燒傷標(biāo)本 以無菌棉拭子直接采取多個部位創(chuàng)面的膿汁分泌物放入無菌塑料盒中。

　2.12、支原體（解脲、人型）培養(yǎng)+藥敏的標(biāo)本采集 2.12.1、支原體對干、熱抵抗力差，標(biāo)本采集后應(yīng)盡快接種支原體運(yùn)送培養(yǎng)基送檢。

　2.12.2、男性：用細(xì)的無菌棉拭子沾取無菌鹽水少許深入尿道口內(nèi)2～2.5cm。

　3、臨床標(biāo)本的保存 細(xì)菌室標(biāo)本原則上要求及時送檢、及時處理，不得保存。

　顯微鏡檢查法操作規(guī)程

　顯微鏡檢查是細(xì)菌鑒定工作中的一重要手段，有助于細(xì)菌的初步鑒別，同時對下一步鑒定工作起著重要的指導(dǎo)作用。有時通過形態(tài)學(xué)檢查可得到初步診斷，如痰中的抗酸桿菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。顯微鏡檢查有不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本檢查法兩種。

　1、不染色標(biāo)本的檢查：不染色標(biāo)本主要用于檢查細(xì)菌的動力及運(yùn)動狀況。

　1.1、壓滴法：用接種環(huán)取細(xì)菌懸液 2 環(huán)，置于清潔載玻片中央，覆上蓋玻片，于高倍鏡下觀察。制片時菌液要適量，不可有氣泡，不可外溢。

　1.2、懸滴法：取潔凈的凹窩載玻片及蓋玻片各 1 塊，將凹孔四周的平面上涂上一層凡士林，取一環(huán)菌液置蓋玻片中央，將凹窩載玻片的凹面向下，對準(zhǔn)于蓋玻片的液滴上，然后迅速翻轉(zhuǎn)玻片，用小鑷子輕壓蓋玻片使之與凹孔邊緣粘緊。鏡下觀察時先低倍后高倍，不可壓碎蓋玻片。有動力的細(xì)菌可見細(xì)菌從一處移到另一處，無動力的細(xì)菌呈布朗運(yùn)動而無位置的改變。螺旋體由于菌體纖細(xì)、透明，需用暗視野顯微鏡觀察其形態(tài)、活動。

　2、染色標(biāo)本檢查法：通過對標(biāo)本的制片及染色，能觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列、染色特性以及莢膜、芽胞、異染顆粒等結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)菌的初步鑒定。

　2.1、快速革蘭染色法 2.1.1、操作見試劑說明書 2.1.2、結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

　2.1.3、注意事項：染色關(guān)健在于涂片和脫色，涂片不宜過厚，固定不宜過熱，脫色不宜過度，菌齡為 18～24 小時為佳。

　2.2、抗酸染色法 2.2.1、操作見試劑說明書 2.2.2、結(jié)果：抗酸桿菌呈紅色。

　2.2.3、注意事項：每一張玻片只能涂一份標(biāo)本且不能在染色缸中染色，以免造成不同標(biāo)本間的交互污染從而導(dǎo)致陰陽性結(jié)果混淆，至無紅色液體流下。

　3、墨汁負(fù)染鏡檢：背景著色而菌體不著色的染色法，用以觀察新型隱球菌的寬厚莢膜等。

　菌室標(biāo)本操作流程

　1、標(biāo)本的接受 1.1、標(biāo)本接受的時間：原則上全天任何時間均可。

　1.2、標(biāo)本的接受：接受標(biāo)本者要認(rèn)真核對標(biāo)本的數(shù)量、標(biāo)本與檢驗(yàn)單要求是否相符以及標(biāo)本的質(zhì)量等。

　1.3、把接受的標(biāo)本編號。

　2、臨床標(biāo)本的接種 2.1、檢驗(yàn)?zāi)康氖羌?xì)菌培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)。各臨床標(biāo)本的培養(yǎng)基選擇如下：

　2.1.1 培養(yǎng)基的選擇 標(biāo)本類型 培養(yǎng)基 血 中段尿 腦脊液 穿刺液 膽汁 呼吸道標(biāo)本 糞便標(biāo)本 病灶分泌物 血培養(yǎng)瓶 血平板、麥康凱平板 血平板、巧克力平板 血平板、麥康凱平板 血平板、麥康凱平板 血平板、麥康凱平板 SS 平板 血平板、麥康凱平板 2.1.2、生殖器標(biāo)本根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗(yàn)項目接種相應(yīng)的平板，操作如下：淋球菌培養(yǎng)接種淋球菌平板；念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基；支原體培養(yǎng)則按《支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程》操作；作普通細(xì)菌培養(yǎng)，則接種血平板和巧克力平板；衣原體抗原檢測的按《衣原體抗原檢測的操作規(guī)程》進(jìn)行檢驗(yàn)。

　2.2、接種的方法：標(biāo)本做分區(qū)劃線。

　2.3、檢驗(yàn)?zāi)康臑檎铱顾釛U菌的按《找抗酸桿菌的操作規(guī)程》進(jìn)行檢驗(yàn)。

　3、所接種的平板必須寫上標(biāo)本的編號和接種的日期，然后根據(jù)要求進(jìn)行培養(yǎng)。

　4、標(biāo)本的培養(yǎng)條件、溫度、時間 平板 培養(yǎng)條件、溫度、時間 血平板 巧克力平板 淋球菌平板 沙保羅平板 其他的平板 孵箱、35—37℃、18—24 小時 孵箱、35—37℃、18—24 小時 孵箱、35—37℃、18—24 小時 孵箱、28—31℃、24—36 小時 孵箱、35—37℃、18—24 小時 5、根據(jù)生長在平板上的細(xì)菌菌落形態(tài)、菌落涂片、染色、鏡檢等來綜合判斷細(xì)菌形態(tài)和染色性質(zhì)，按各屬鑒定的作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行各菌屬的常規(guī)鑒定及藥敏試驗(yàn)。

　6、結(jié)果的報告 確認(rèn)細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果后，進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)單結(jié)果報告的存盤、打印。

　7、對各類細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本除特殊要求外，我室一般操作完后按要求進(jìn)行無害化處理。

　細(xì)菌的形態(tài)檢查操作規(guī)程

　1、不染色標(biāo)本的檢查 壓滴法和懸滴法。主要用于檢查生活狀態(tài)下的細(xì)菌的動力及運(yùn)動狀況。將特制好的標(biāo)本置于顯微鏡載物臺中央，先以低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。

　結(jié)果：有鞭毛的細(xì)菌呈穿梭似流星狀運(yùn)動(有明顯的方向性)；無鞭毛的細(xì)菌呈布朗運(yùn)動(只在原地顫動而無位置的改變)。

　2、細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查 染色的第一步是制作涂片。菌落涂片時，先取生理鹽水 l 滴，置玻片上，用接種針挑取菌落，在鹽水中涂布。涂片時必須注意應(yīng)輕輕操作。猛烈的動作會改變菌細(xì)胞原有的排列形式，或造成細(xì)菌鞭毛脫落，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。制備的涂片應(yīng)自然干燥，并經(jīng)火焰固定，固定溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背不燙為準(zhǔn)，否則可能使細(xì)胞形態(tài)改變。將固定后的涂片進(jìn)行染色。

　2.1、革蘭染色 本染色是最基本的染色法，可用于標(biāo)本涂片或菌落涂片。染色結(jié)果將細(xì)菌分為革蘭陽性(紫色)和革蘭陰性(紅色)兩類。

　2.1.1、試劑 (1) 結(jié)晶紫溶液

　 A 液：

　 結(jié)晶紫

　 2g

　95％乙醇

　 20ml

　 B 液：

　 草酸銨

　 0.8g

　蒸餾水

　 80ml 需在用前 24h 將 A 液、B 液混合，過濾后裝入試劑瓶內(nèi)備用。

　(2) 碘液

　 碘

　 lg

　 碘化鉀

　 2g

　 蒸餾水

　 300ml 碘與碘化鉀混合并研磨，加入幾毫升水，使其逐漸溶解，然后研磨，繼續(xù)加入少量蒸餾水至完全溶解。最后補(bǔ)足水量。

　也可用少量蒸餾水，先將碘化鉀完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至 300ml。

　(3) 脫色液：95％乙醇。

　(4) 復(fù)染液

　 A．

　貯存液：沙黃

　 2.5g

　95%乙醇

　100ml

　B．

　應(yīng)用液：

　A 液

　 10ml

　蒸餾水

　90ml 染色方法：

　(1)．涂片經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫液染 1 min，清水沖去染液。

　(2)．加碘液染 1 min，水洗。

　(3)．加脫色液，不時搖動約 10～30s，至無紫色脫落為止，水洗。

　(4)．加復(fù)染液，染 30s，水洗。

　(5)．干后鏡檢。

　2.2、抗酸染色 抗酸染色直接用于痰標(biāo)本時，可以適當(dāng)增加標(biāo)本涂片的厚度，以提高檢出率。染厚涂片時，須掌握復(fù)染色時間。如果背景過深，影響鏡檢。

　奴卡菌及放線菌可呈弱抗酸性，取培養(yǎng)菌落涂片染色時，呈現(xiàn)兩種現(xiàn)象，視野中有些菌陽性，另外一些則陰性；有時同一個菌體上，紅色的深淺亦有不同，觀察時應(yīng)予注意。

　試

　劑

　(1)、石炭酸復(fù)紅溶液

　 堿性復(fù)紅乙醇飽和溶液

　 10ml

　 5％石炭酸溶液

　90ml

　(2)、脫色劑

　濃鹽酸

　 3ml

　95%乙醇

　 97ml

　(3)、復(fù)染液(呂弗勒美藍(lán)液)

　 美藍(lán)乙醇飽和溶液

　30ml

　10％氫氧化鉀

　0.1m1

　 蒸餾水

　100ml 染色方法 (1)、涂片經(jīng)火焰固定，加石炭酸復(fù)紅溶液，徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，切不可沸騰，持續(xù)約 5 min（若染色奴卡菌需要加長時間），水洗。

　(2)、加脫色劑，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗。

　(3)、加復(fù)染液，染 0.5～l min，水洗。

　(4)、干后鏡檢。分枝桿菌呈紅色，背景為藍(lán)色。

　注：奴卡菌、放線菌標(biāo)本染色時，脫色劑改用 2％硫酸水溶液。

　2.3、墨汁莢膜染色 用于觀察菌體有無莢膜結(jié)構(gòu)，借此鑒定某些菌，如新型隱球菌。

　傳統(tǒng)的方法是用印度墨汁，但目前國內(nèi)無售。常規(guī)工作可以用墨汁或墨水代替，但應(yīng)注意顆粒不能太粗，否則影響觀察結(jié)果。有人用 5％黑色素水溶液做染料，效果較好。

　試 劑 印度墨汁或 5％黑色素水溶液。

　染色方法 將標(biāo)本與 1 滴染色液在載玻片上混合，加上蓋玻片，輕輕壓一下，使標(biāo)本混合液變薄。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細(xì)胞。找到后，轉(zhuǎn)換高倍鏡確認(rèn)。

　細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定及其它試驗(yàn)操作規(guī)程

　1、氧化-發(fā)酵試驗(yàn)(O-F 試驗(yàn)) 原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型。可以進(jìn)行無氧降解的，稱為發(fā)酵型(發(fā)酵型細(xì)菌在有氧無氧的條件下均能分解葡萄糖)。不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。

　方法：將待檢細(xì)菌同時穿刺接種兩支 Hugh-Leifson 培養(yǎng)基，其中一支培養(yǎng)基滴加無菌石蠟(或其它礦物油)，高度不少于 lcm。35℃，24 小時或更長。

　結(jié)果：培養(yǎng)基變黃表示細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，兩支培養(yǎng)基均無變化為產(chǎn)堿型或不分解糖型；兩支培養(yǎng)基均均產(chǎn)酸為發(fā)酵型。若僅不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸為氧化型。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵細(xì)菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者均為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌問的鑒別。

　2、β-半乳糖苷酶(ONPG)試驗(yàn) 原理：細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶，分解鄰-硝基酚β-D-半乳糖苷(無色)生成鄰-硝基酚(黃色)。

　結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng)，一般在 20-30 分鐘內(nèi)顯色。

　應(yīng)用：主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。

　3、七葉苷水解試驗(yàn) 原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應(yīng)，生成黑色的化合物。

　結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變色為陰性。

　應(yīng)用：主要用于 D 群鏈球菌與其它鏈球菌的鑒別。前者為陽性，后者為陰性。也可用于革蘭陰性菌與厭氧菌的鑒別。

　4．甲基紅試驗(yàn) 原理：某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基 pH 值降至 4.5 以下，加入甲基紅呈現(xiàn)紅色為陽性。若細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物，則培養(yǎng)基 pH 值仍在 6.2 以上，加入甲基紅呈現(xiàn)黃色為陰性。

　結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽性，橘紅色為弱陽性。黃色為陰性。

　應(yīng)用：主要用于鑒別大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌，前者陽性，后者陰性。此外腸桿菌科中變形桿菌屬、沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬和志賀菌屬等陽性，而腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬則為陰性。

　5、VP 試驗(yàn) 原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，氧化為二乙酰，與精氨酸中的胍基作用生成紅色化合物。

　結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，如無紅色出現(xiàn)且于 35℃4h 后仍如故者即為陰性。

　應(yīng)用：本試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢哧栃缘募?xì)菌，后者通常為陰性。

　6、吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn) 原理：細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚(靛基質(zhì))，加入對位二甲基苯甲醛生成紅色玫瑰吲哚。

　結(jié)果：于兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科的鑒定。

　6、尿素分解試驗(yàn) 原理：具有尿素酶(尿酶)的細(xì)菌，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，培養(yǎng)基變堿。

　結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變色為陰性。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定，奇異變形桿菌、普通變形桿菌為陽性，克雷伯菌屬、枸椽酸菌屬、雷氏普羅威登菌和摩根摩根菌為陽性。

　7、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) 原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨生成苯丙酮酸，加入 FeCl 3 生成綠色化合物。

　結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽性，應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長會引起退色。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科的鑒定，變形桿菌屬、普羅威登斯菌和摩根摩根菌均為陽性。腸桿菌科其它菌均為陰性。

　8、氨基酸脫羧酶試驗(yàn) 原理：具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，分解氨基酸脫羧生成胺和 CO 2 使培養(yǎng)基變堿，指示劑改變顏色。

　結(jié)果：對照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色(指示劑為溴甲酚紫)為陽性。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。

　9、氧化酶試驗(yàn) 原理：氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素 C 氧化，再由氧化型細(xì)胞色素 C 使對苯二氨氧化。生成有色醌類化合物。

　結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸 10 秒內(nèi)呈紫色為陽性。為保證結(jié)果準(zhǔn)確性，應(yīng)作陰、陽性對照。

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與假單胞菌的鑒別，前者為陰性。后者為陽性。

　10、過氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn)) 原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。

　試劑：3％過氧化氫溶液 方法：取菌置于潔凈的試管或玻片上，然后滴加 3％過氧化氫數(shù)滴；或直接滴加 3％過氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)基中，立即觀察結(jié)果。

　結(jié)果：有大量氣泡產(chǎn)生為陽性。不產(chǎn)生氣泡為陰性。

　應(yīng)用：革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均陽性。而鏈球菌均陰性。

　1l、硝酸鹽還原試驗(yàn) 原理：包括兩個過程：一是在合成過程中，硝酸鹽還原為亞哨酸鹽和氨。再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)菌內(nèi)其它含氮化合物。二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的受氫體，能使硝酸鹽還原的細(xì)菌從哨酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其它還原性產(chǎn)物。

　結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性。若加入試劑后無顏色變化反應(yīng)，可能是①硝酸鹽沒有被還原，試驗(yàn)陰性。②硝酸鹽被還原為氨和氮等其它產(chǎn)物而導(dǎo)致假陰性，這時應(yīng)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗(yàn)確實(shí)為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表明為試驗(yàn)為假陰性。

　應(yīng)用：本試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中應(yīng)用廣泛。

　12、氧化酶(改良法)試驗(yàn) 試劑：

　四甲基對苯二胺(TMPD)

　 6.0g 二甲基亞砜(DMSO)

　 100.oml 溶解 TMPD 于 DMSO 中，置于避光玻塞瓶中，可在室溫中保留幾個星期。

　方法：被檢菌株移種于 7％羊血瓊脂上，30℃需氧條件下孵育 15～18h，刮取菌落涂布于無色濾紙片上，加 l 滴上述試劑，陽性者在 2min 內(nèi)呈深藍(lán)色。

　若被測菌株移種在蛋白胨酵母浸出液瓊脂上，至少孵育 3 天以上，才可檢測，陽性反應(yīng) 5～10min 出現(xiàn)。

　13、CAMP 試驗(yàn) 原理：B 群鏈球菌能產(chǎn)生 CAMP 因子，可促進(jìn)葡萄球菌的β-溶血素溶解紅細(xì)胞活性，因此在兩菌的交界處溶血力增加。出現(xiàn)矢形(半月形)的溶血區(qū)。

　結(jié)果：在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣的溶血區(qū)為陽性 應(yīng)用：在鏈球菌中，只有 B 群鏈球菌 CAMP 試驗(yàn)陽性。

　14、O/129 抑菌試驗(yàn) 原理：O/129(二氨基喋啶)對弧菌屬、鄰單胞菌屬細(xì)菌有抑制作用，而對氣單胞菌無抑制作用。

　方法：將待檢菌均勻涂布于堿性瓊脂平板上，鑷取 O/129 紙片(含藥 40ug)貼于平板上，35℃，18~24h，觀察結(jié)果。

　結(jié)果：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，無抑菌環(huán)為耐藥 應(yīng)用：弧菌屬、鄰單胞菌屬對 O／129 敏感，而氣單胞菌屬耐藥 15、桿菌肽試驗(yàn) 原理：A 群鏈球菌對桿菌肽幾乎全部敏感，而其它鏈球菌絕大多數(shù)對其耐藥。

　16、奧普托欣試驗(yàn) 原理：幾乎所有的肺炎鏈球菌對 Optochin 敏感，而 Optochin 對其它鏈球菌則無抑制作用 17、．H 2 S 試驗(yàn)

　原理：有些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸(如胱胺酸、半胱胺酸)產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇到鉛或亞鐵離子，則生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。

　結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?/p>

　應(yīng)用：主要用于腸桿菌科屬或種的鑒定。

　18、觸酶試驗(yàn)(過氧化氫酶試驗(yàn)) 試劑：3%H 2 0 2 溶液，置棕色瓶內(nèi)于 4℃陰暗處保存。

　方法：先挑取固體培養(yǎng)基上的菌落，置于潔凈的玻片上，然后滴加 3％過氧化氫溶液 1～2 滴。靜置之，lmin 內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡的為陽性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性。

　19、葡萄球菌凝固酶和凝聚因子試驗(yàn) 葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。試管法凝固酶試驗(yàn)稱為葡萄球菌凝固酶，玻片法為檢測凝聚因子。

　19.1 凝聚因子試驗(yàn)：取 1 滴蒸餾水于潔凈的玻片上，用接種環(huán)挑取待檢菌一環(huán)置于蒸餾水中，制成濃的菌懸液，無自凝現(xiàn)象。然后加一環(huán)家兔血漿混合，10s 內(nèi)觀察結(jié)果，出現(xiàn)明顯細(xì)菌凝塊為陽性，否則為陰性。如超過 10s 可出現(xiàn)假陽性，有 10％～15％金黃色葡萄球菌呈假陰性，因此必須用試管法驗(yàn)證凝聚因子試驗(yàn)。

　操作過程中的注意點(diǎn)：

　(1)10s 內(nèi)觀察結(jié)果。

　(2)必須制備濃厚的均勻菌懸液。

　(3)用 EDTA 抗凝的兔血漿為最好。

　(4)加血漿后不要再混攪，以免細(xì)菌凝塊分散變小。

　(5)生長在高鹽培養(yǎng)基上的菌落可出現(xiàn)自凝或假陽性。

　19.2 葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)：用生理鹽水將血漿 4 倍稀釋，取 0.5ml。然后挑取 3～5 個菌落于稀釋血漿中，成濃菌懸液。置 37℃水浴，3～4h 后讀取結(jié)果，凝固者為陽性。若陰性，繼續(xù)觀察到 24h，不凝固者為陰性。試驗(yàn)應(yīng)同時作陽性、陰性對照。

　試管法葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)陽性者，應(yīng)見到明顯的纖維蛋白凝膠塊，出現(xiàn)羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固，應(yīng)判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄

　球菌需要較長時間孵育，才可出現(xiàn)陽性。凝固酶試驗(yàn)應(yīng)考慮下述情況：

�、倌承┙瘘S色葡萄球菌產(chǎn)生溶纖維蛋白酶，溶解纖維蛋白凝塊。

�、谒�用血漿缺乏纖維蛋白原。

�、墼囼�(yàn)菌株不純。

　結(jié)果：玻片法以血漿中有明顯的顆粒出現(xiàn)而鹽水中無自凝現(xiàn)象判為陽性；試管法以血漿凝固為陽性。

　應(yīng)用：作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗(yàn)。

　20、新生霉素耐藥試驗(yàn) 方法：挑取待檢菌菌落數(shù)個，制成相當(dāng) 0.5 號麥?zhǔn)瞎?McFarland)濃度菌液，棉拭子浸透，擠去多余液，均勻涂在 M-H 平板上，貼上含 5ug／片的新生霉素紙片，35℃孵育 16～20h，抑菌環(huán)直徑≤16 為陽性(耐藥)。試驗(yàn)時應(yīng)以金黃色葡萄球菌 ATCC25923 做陰性(敏感)對照，以確認(rèn)紙片是否有效。

　細(xì)菌的接種與培養(yǎng)方法操作規(guī)程

　一、細(xì)菌的接種 根據(jù)待檢標(biāo)本的來源、培養(yǎng)目的及所用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的接種方法。

　l、平板畫線分離法 （1）、連續(xù)畫線分離法此法主要用于雜菌不多的標(biāo)本。用接種環(huán)取標(biāo)本少許，于平板 l/5 處密集涂布，然后回來作曲線連續(xù)劃線接種，線與線間有一定距離，劃滿平板為止。

　（2）、分區(qū)畫線分離法此法適用于雜菌較多的標(biāo)本。先將標(biāo)本均勻涂布于平板邊緣一小區(qū) (約占平板 1/5)，再在二、三區(qū)依次連續(xù)畫線，每畫線一區(qū)均將接種針滅菌一次。每一區(qū)的劃線均接觸上一區(qū)的接種線 1～2 次。以獲得單個菌落。

　2、斜面接種法 該法主要用于單個菌落的純培養(yǎng)。用滅菌接種針取菌少許，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線畫線。一直畫到斜面頂端。

　3、液體接種法 多用于一些液體生化試驗(yàn)管的接種。用滅菌接種環(huán)取菌少許，在試管內(nèi)壁與液面交接處的管壁上輕輕研磨，使細(xì)菌混合于液體中。

　4、穿刺接種法 主要用于半固體培養(yǎng)基、明膠及雙糖鐵的接種。用接種針取菌少許，從半固體培養(yǎng)基中央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接觸管底，然后接種針原路退出。

　5、傾注平板法 臨床上主要用于尿液等標(biāo)本的細(xì)菌計數(shù)。將標(biāo)本經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi)，傾入已經(jīng)溶化并冷卻至 45℃左右的定量培養(yǎng)基，混勻，待凝固后倒置、培養(yǎng)。

　6、涂布接種法 常用于紙片藥物敏感性測定，也可用于被檢標(biāo)本的細(xì)菌計數(shù)。加定量的被

　檢菌液于瓊脂平板表面，然后用滅菌的棉簽反復(fù)涂布幾次，使被檢菌均勻分布在瓊脂平板表面。然后貼上藥敏紙片培養(yǎng)，或直接培養(yǎng)觀察結(jié)果。

　二、細(xì)菌培養(yǎng)方法 根據(jù)臨床初步診斷及待檢細(xì)菌的種類，可選用不同的環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)。常用的有需氧培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法。

　1、需氧培養(yǎng)法 本法是臨床細(xì)菌室常用的培養(yǎng)方法，即將已經(jīng)接種好的平板、斜面和液體培養(yǎng)基等。置于 35℃溫箱中孵育 18～24 小時。

　2、二氧化碳培養(yǎng)法 本室用 CO 2 孵箱將已接種好的培養(yǎng)基置于 CO 2 孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

　三、分離及純化法 3.1、分離是指從原材料或多種細(xì)菌的混合培養(yǎng)物中將各種細(xì)菌彼此獨(dú)立地分離開，以得到純的單一菌株，技術(shù)步驟如下：

　作純培養(yǎng)分離時，一般只用一只完整的瓊脂平板。涂劃多采用分區(qū)劃線法，在一只平板中可劃 3～5 個區(qū)。劃法有兩種：

　3.1.1、從臨床標(biāo)本分離細(xì)菌所含菌數(shù)相對較少時，可用接種環(huán)取標(biāo)本涂布在平板一角邊緣，然后從此區(qū)開始劃線至 1／3 平板，為第一區(qū)，再在 2、3 區(qū)依次劃線，每劃完一個區(qū)域均將接種環(huán)滅菌一次，冷卻后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線 1～2 次，使菌量逐漸減少以獲得單個菌落。

　3.1.2、快速劃線分離法：采用快速劃線使一接種環(huán)標(biāo)本能分離出單個菌落，這與標(biāo)本的菌量及操作者的技能有很大關(guān)系。

　3.2、純化是指欲獲得大量純培養(yǎng)物的方法，所用平板大小可根據(jù)需要的菌量而定。方法是將一單個菌落或?qū)⑾嗤�的菌落作大量密集涂劃于平板上而獲得大量純的培養(yǎng)物。

　支原體培養(yǎng)、鑒定 及藥敏 操作規(guī)程

　1．原理及依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：

　支原體分離鑒定培養(yǎng)基用于泌尿生殖道支原體(解脲支原體 Uu 和人型支原體 Mh)的檢測與診斷。當(dāng)有 Uu 和 Mh 生長，分解尿素和精氨酸引起 PH 上升，使以酚紅為指示劑的培養(yǎng)基由黃轉(zhuǎn)紅。依據(jù)珠海迪爾生物工程有限公司生產(chǎn)的試劑盒說明書。

　2．標(biāo)本的采集：

　2.1、男性：用特別細(xì)的無菌棉拭子沾取無菌生理鹽水少許深入尿道口內(nèi) 2～2.5cm 處取分泌物，前列腺液亦可用沾取無菌生理鹽水的無菌棉拭子盡量多的沾取。

　2.2、女性：用沾取少許無菌生理鹽水的棉拭子取宮頸內(nèi)口 1～2cm 處單層柱狀上皮細(xì)胞，取樣拭子不可碰陰道壁。

　2.3、支原體對干、熱抵抗力差，標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢。整個采樣過程應(yīng)注意無菌操作。

　3、標(biāo)本接種：(本實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意無菌操作，避免污染雜菌) 3.1、取出培養(yǎng)基，放置接近室溫，并在瓶蓋上編號。

　3.2、將采集的標(biāo)本拭子插入培養(yǎng)瓶中，在靠近液面上方的瓶壁擠示壓旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，使拭子中標(biāo)本滲入到肉湯中：若為液體標(biāo)本，取 200 u 1 加入培養(yǎng)基中；若為中段尿，經(jīng) 3000 轉(zhuǎn)／分離心 15 分鐘取沉渣 100ul 加入培養(yǎng)基中。

　3.3、蓋上瓶蓋，置 35～37℃孵箱，在 24～48 小時分別觀察結(jié)果。

　4、結(jié)果判讀：

　培養(yǎng)基變紅，判斷陽性，培養(yǎng)基黃色并清亮，判斷陰性。

　5、已檢標(biāo)本處理：密閉容器高壓滅菌后，按醫(yī)用垃圾處理。

　血液感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、標(biāo)本采集 (1)、采集時間和次數(shù)血標(biāo)本一般應(yīng)在病人發(fā)熱初期或根據(jù)不同的發(fā)熱情況在未用抗生素前采集做細(xì)菌培養(yǎng)，提高陽性率需連續(xù)三次采血進(jìn)行培養(yǎng)。

　(2)、采血部位及抽血量一般抽取肘靜脈血。采血量為成人 5~10ml，兒童為3～5ml。

　(3)、結(jié)果觀察：培養(yǎng) 72 小時后若肉眼或自動血液培養(yǎng)儀報告仍未細(xì)菌生長，則盲目移種一次，仍未細(xì)菌生長，向臨床發(fā)出一級初級報告：“血液經(jīng) 72小時培養(yǎng)無細(xì)菌生長”，為避免漏診，應(yīng)在培養(yǎng) 5 天、7 天時再作盲目移種培養(yǎng)。疑為亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、真菌血癥等時，血培養(yǎng)至少連續(xù)培養(yǎng) 2～3 周，仍無細(xì)菌生長方可報告為陰性。

　2、檢驗(yàn)程序

　3、血培養(yǎng)瓶中不同表現(xiàn)為不同細(xì)菌生長：

　渾濁并有凝無塊

　均勻渾濁，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣

　微渾濁，有綠色變化

　表面有菌膜，培養(yǎng)基清晰，底層容血

　表面有菌膜，膜下有綠色渾濁

　血細(xì)胞層上面有顆粒狀生長，自上而下的溶血 金黃色葡萄球菌 多為革蘭陰性菌 肺炎鏈球菌 枯草桿菌 銅綠假單胞菌 溶血性鏈球菌

　4、血液及骨髓標(biāo)本中常見病原菌 革蘭陽性菌

　革蘭陰性菌 肺炎鏈球菌

　大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌

　傷寒及其它沙門菌 表皮葡萄球菌

　變形桿菌 溶血性鏈球菌

　產(chǎn)氣腸桿菌 糞腸球菌

　肺炎克雷伯氏菌 銅綠假單胞菌 糞產(chǎn)鹼桿菌 沙雷氏菌 流感嗜血桿菌 布魯氏菌 5、報告結(jié)果 血培養(yǎng)陽性均作為危急值報告，所以血培養(yǎng)的結(jié)果應(yīng)及時通知臨床醫(yī)生，每日開始工作可以首先檢查血培養(yǎng)，如有細(xì)菌生長，立即處理。

　5.1、疑有細(xì)菌生長者，經(jīng)涂片、革蘭氏染色、鏡檢后，電話通知主治醫(yī)生，報告“疑有革蘭氏××菌生長”。并做藥敏試驗(yàn)，報告初步結(jié)果。

　5.2、經(jīng)分純培養(yǎng)完成鑒定及藥敏試驗(yàn)，發(fā)出報告。

　5.3、培養(yǎng) 7 天仍為陰性的標(biāo)本，報告無細(xì)菌生長。

　臨床上診斷為亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎者，可持續(xù)培養(yǎng)至兩周再發(fā)陰性報告。

　中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　l、標(biāo)本采集

　以無菌方法采集腦脊液 2～5ml，盛于無菌瓶中送檢。

　2、直接檢查

　腦脊液可直接涂片、革蘭染色或抗酸染色等，然后鏡檢。無色透明的腦脊液，應(yīng)作離心取沉淀物涂片、染色鏡檢。

　3、檢驗(yàn)步驟：

　3.1、一般細(xì)菌涂片檢查除結(jié)核性腦膜炎外，由其它細(xì)菌引起的化膿性腦膜炎，腦脊液明顯混濁，可直接涂片，革蘭染色鏡檢。無色透明的腦脊液，應(yīng)離心后涂片、染色、鏡檢，根據(jù)染色及形態(tài)特征可初步提示細(xì)菌的種類。結(jié)核分枝桿菌涂片檢查：取腦脊液的離心沉淀物(3000r／min。30min)作抗酸染色。新型隱球菌涂片檢查：取腦脊液的離心沉淀物作墨汁負(fù)染色。

　3.2、分離培養(yǎng)用接種環(huán)挑取混濁腦脊液或經(jīng)離心沉淀的沉淀物，分別接種于血平板、巧克力平板，巧克力平板應(yīng)置于 CO 2 環(huán)境中 35℃培養(yǎng) 18～24 小時。腦脊液也可直接注入血培養(yǎng)瓶。

　4、檢驗(yàn)程序

　5、腦脊液培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽性菌

　革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌

　腦膜炎奈瑟菌

　 A、B 群鏈球菌

　 卡他布蘭漢菌

　 肺炎鏈球菌

　流感嗜血桿菌

　 結(jié)核分支桿菌

　腸桿菌科菌種

　 產(chǎn)單核李斯特菌

　腦膜敗血性黃桿菌

　 新型隱球菌

　假單胞菌

　 白色念珠菌 6、報告結(jié)果 無論是涂片還是培養(yǎng)，一但見到陽性菌應(yīng)立即通知臨床醫(yī)師。培養(yǎng)并經(jīng)鑒定的結(jié)果報告“××菌”，同時報告藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

　下呼吸道感染病 原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、標(biāo)本的采集 有自然咳痰法、咽拭子采集法、支氣管鏡下采集法及分泌物標(biāo)本。

　2、標(biāo)本的直接檢查 (1)、將痰標(biāo)本涂片后待干，固定、染色，或直接濕片鏡檢，對病原學(xué)早期、初步診斷有重要意義。并向臨床發(fā)出初級報告。

　(2)、一般認(rèn)為合格的痰標(biāo)本為：以白細(xì)胞≥25 個/低倍鏡視野，而上皮細(xì)胞≤10 個/低倍鏡視野。采集合格標(biāo)本對細(xì)菌的診斷尤為重要。

　3、分離培養(yǎng)與鑒定 (1)、一般要求下呼吸道感染培養(yǎng)的細(xì)菌濃度應(yīng)>10 7 CFU/ml，可視為病原菌，<10 4 CFU/ml 可視為污染菌。若介于兩者之間 10 5 ～10 6 CFU／ml 時，要連續(xù)分離培養(yǎng)兩次以上仍為 10 5 ～10 6 CFU／ml 時，亦認(rèn)為是病原菌。

　(2)、檢驗(yàn)程序

　4、下呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽性菌

　 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌

　 腦膜炎奈瑟氏菌

　 化膿性鏈球菌

　 流感嗜血桿菌

　 肺炎鏈球菌

　 腸桿菌科細(xì)菌

　 結(jié)核分支桿菌

　 非發(fā)酵菌

　 白喉棒狀桿菌

　 嗜肺軍團(tuán)菌

　 假絲酵母菌 5、報告結(jié)果 痰中的病原菌不少屬于機(jī)會致病菌，與正常菌群同時存在，報告時應(yīng)作說明，未檢出致病菌時，應(yīng)報告“無致病細(xì)菌生長”。

　尿路感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、尿液培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽性菌

　革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌

　淋病奈瑟菌

　 腸球菌

　大腸埃希菌

　 A 群鏈球菌

　變形桿菌

　 腐生葡萄球菌

　肺炎克雷伯菌

　 表皮葡萄球菌

　產(chǎn)氣腸桿菌

　 結(jié)核分支桿菌

　沙門菌種

　 銅綠假單胞菌

　 沙雷菌 2、標(biāo)本收集 2.1、尿液標(biāo)本的采集可采用多種方法：有中段尿采集法、膀胱穿刺法、腎盂尿采集法，而常規(guī)是取中段尿作細(xì)菌培養(yǎng)。

　2.2、取中段尿作培養(yǎng)時先要進(jìn)行前尿道的清洗消毒，以免前尿道寄生菌群污染標(biāo)本。

　2.3、如采用其他方法收集標(biāo)本，必須由臨床醫(yī)生根據(jù)臨床診斷需要而執(zhí)行收集術(shù)，并在檢驗(yàn)單上寫明。

　3、檢驗(yàn)步驟 3.1、涂片檢查 3.1.1、一般細(xì)菌及淋病奈瑟菌涂片：以無菌操作吸取尿液 10ml，3000r/min離心 15min，去上清液，取沉淀涂片，革蘭氏染色鏡檢，作初步報告。如查見革蘭氏陰性雙球菌，呈腎形位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，報告“找到革蘭陰性雙球菌，存在于細(xì)胞內(nèi)外，形似淋病奈瑟菌”。如未查見上述細(xì)菌可報告“未發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌”。

　3.1.2、念珠菌涂片：取尿液沉淀物放于清潔玻片上，覆以蓋玻片，制成涂片，用高倍鏡檢查。革蘭染色后，如發(fā)現(xiàn)發(fā)亮的芽生孢子和假菌絲，就可報告“霉菌孢子及菌絲”。

　3.1.3、結(jié)核分枝桿菌：取尿液 10ml，4000r/min 離心 30min，取沉淀物涂片，抗酸染色，鏡檢。如找到紅色桿菌，可報告“查到抗酸桿菌”。

　3.2、一般細(xì)菌培養(yǎng)(細(xì)菌計數(shù))：用定量接種環(huán)取尿液 10 u l 接種血平板，35℃培養(yǎng) 18～24 小時，觀察有無細(xì)菌生長，并計數(shù)菌落數(shù)，乘以 1000，求出每毫升尿液的菌落數(shù)。根據(jù)菌落特征、涂片染色結(jié)果，進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，如培養(yǎng) 48 小時無菌生長，即報告“無細(xì)菌生長”。

　3.3、特殊菌培養(yǎng)：淋病奈瑟菌培養(yǎng)，選用專用巧克力瓊脂平板，接種后放入二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)。

　4、檢驗(yàn)程序

　5、結(jié)果報告：

　5.1、尿液細(xì)菌培養(yǎng)檢查必須報告細(xì)菌的種屬、菌落計數(shù)(cfu/m1)及藥敏結(jié)果。

　5.2、革蘭氏陰性菌落計數(shù)大于 10 5 cfu/ml，革蘭氏陽性菌計數(shù)大于 10 4 cfu/ml，真菌大于 10 3 cfu/ml 有診斷意義。

　5.3、一般常規(guī)結(jié)核培養(yǎng)要 8 周方能報告。陽性結(jié)果可提前報告。但不做菌落計數(shù)只報告“抗酸桿菌生長”的報告，如做了進(jìn)一步的分型和鑒定，才能報

　告“有××型結(jié)核桿菌生長”。

　5.4、用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)淋球菌經(jīng)鑒定可直接報告“有淋球菌生長”但不做菌落計數(shù)，如涂片發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)或外有革蘭氏陰性雙球菌可報告“發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌”。

　5.5、如尿液培養(yǎng)同時有三種或以上細(xì)菌生長時，可視為污染標(biāo)本，建議重留送檢。

　消化道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、糞便標(biāo)本中常見病原菌 革蘭陽性菌

　 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌

　 傷寒及其它沙門菌 結(jié)核分支桿菌

　 志賀菌屬 難辨梭菌

　 致病大腸埃希菌 白色念珠菌

　 (ETEC、EPEC、EIEC、EHEC) 弧菌屬菌種 氣單胞、鄰單胞菌種 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 彎曲菌 2、標(biāo)本采集 2.1、自然排便采集法：自然排便后，挑取膿血、粘膜部分的糞便 2～3g，液體糞便取絮狀物置于大便培養(yǎng)管或增菌液中送檢。

　2.2、直腸肛管法：用大便培養(yǎng)用的肛管直接插入肛門成人 4～5cm，幼兒 2～3cm，輕輕在直腸內(nèi)旋轉(zhuǎn)數(shù)次，目的是使直腸表面粘液能通過肛管孔進(jìn)入肛管內(nèi)。然后拔出放入大便培養(yǎng)管中送檢。

　3、檢驗(yàn)步驟 3.1、涂片檢查糞便標(biāo)本因各種正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致病菌，只有懷疑霍亂弧菌及菌群失調(diào)所致腹瀉時，才作直接涂片檢查。

　3.2、各項的涂片檢驗(yàn)均按染色方法進(jìn)行，但大便檢查霍亂弧菌的處理程序：

　3.2.1、染色檢查：將米泔樣的標(biāo)本涂 2 張片用乙醇固定后染色，觀察弧菌有無呈魚群狀排列。

　3.2.2 懸滴檢查：取患者糞便制成懸滴涂片，霍亂弧菌古典型和 EL-Tor 型均呈現(xiàn)極活潑的穿梭狀運(yùn)動。

　3.2.3 制動檢驗(yàn)：運(yùn)動活潑的弧菌涂片加人霍亂弧菌診斷血清后，在顯微鏡下觀察，若原運(yùn)動活潑的現(xiàn)象停止，為制動試驗(yàn)陽性。

　3.3、大便標(biāo)本的培養(yǎng)目的是培養(yǎng)致病菌或追蹤病人有否菌群失調(diào)現(xiàn)象，無

　特殊要求作一般致病菌培養(yǎng)的標(biāo)本接種麥康凱、SS 平板各一個。

　3.4、菌群失調(diào)的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)：選用多種培養(yǎng)基包括 SS、麥康凱、血平板、高鹽甘露醇鹽瓊脂平板、Campy-BA 血瓊脂平板和沙氏瓊脂等，目的是使更多的菌群得到生長，以利于檢查腸道的細(xì)菌情況。

　3.5、霍亂弧菌的培養(yǎng)：直接取患者米泔樣糞便 0.5ml，接種于堿性蛋白胨水增菌液和 4 號平板，35℃培養(yǎng) 6～8h，再轉(zhuǎn)種一只 4 號平板。35 ℃培養(yǎng) 18～24h 后形成較大、菌落中間為灰黑色、有光澤、隆起、濕潤的菌落，如潑水狀。挑取可疑菌落 5～10 個與霍亂多價“O”血清作凝集試驗(yàn)。

　診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)，如為陽性，則立即報告，并將可疑菌送疾病控制中心確認(rèn)。

　3.6、真菌培養(yǎng)：真菌性腹瀉多繼發(fā)于抗生素治療后，常見的真菌腹瀉多由白色假絲酵母菌引起。將標(biāo)本接種于沙氏平板及血平板上，置 27℃和 35℃培養(yǎng)18～24h，根據(jù)形態(tài)染色、菌落特征，做真菌鑒定和藥敏試驗(yàn)。

　4、檢驗(yàn)程序

　5、結(jié)果報告 糞便培養(yǎng)的報告方式應(yīng)以分離目的菌種的結(jié)果而定，如：目前常規(guī)以 SS 培養(yǎng)基分離糞便中的致病菌，陽性者應(yīng)報告“檢出沙門菌或檢出志賀菌”，陰性者報告“未檢出沙門菌或未檢出志賀菌”。其他培養(yǎng)結(jié)果報告方式與上述原則相同。

　膿汁及病灶分泌物細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)程

　1、膿汁及病灶分泌物培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽性菌

　革蘭陰性菌 葡萄球菌

　腸桿菌科細(xì)菌

　 鏈球菌

　假單胞菌

　 炭疽芽孢桿菌

　擬桿菌

　 破傷風(fēng)芽孢桿菌

　腐敗謝瓦納拉菌

　 產(chǎn)氣莢膜梭菌

　嗜血桿菌

　 結(jié)核分枝桿菌

　產(chǎn)堿桿菌

　 放線菌、奴卡菌

　弧菌屬細(xì)菌

　 念珠菌

　氣單胞菌 2、標(biāo)本采集：標(biāo)本由臨床醫(yī)師行無菌操作術(shù)采集，但應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

　2.l、閉鎖性膿腫疑為厭氧菌感染時，取材后立即將空氣排空，同時針尖插入橡皮塞內(nèi)防止空氣進(jìn)入，連同注射器一并送檢。

　2.2、開放膿腫、膿性分泌物可在患部直接用棉拭或紗布擦抹，如為瘺管亦可在無菌操作下取組織碎片分散在無菌鹽水中。

　2.3、燒傷創(chuàng)面的分泌物，用滅菌棉拭取多部位創(chuàng)面的膿液或分泌物，置無菌試管中送檢。

　2.4、取尿道分泌物必須先清洗、消毒尿道后用擠壓法使分泌物從尿道溢出，用無菌生理鹽水浸濕拭子直接采集標(biāo)本。如女性做宮頸分泌物細(xì)菌培養(yǎng)，應(yīng)盡量避免雜菌污染。

　2.5、組織臟器碎片的收集，先要消毒表面的污染菌，后用無菌刀切開，取內(nèi)容物及碎片分散于無菌生理鹽水中，然后增菌、接種，如活體微量標(biāo)本可直接放人肉湯增菌培養(yǎng)基中增菌。

　3、檢驗(yàn)步驟 3.1、涂片檢查：膿汁及分泌物標(biāo)本均應(yīng)做涂片檢查。涂片做革蘭氏染色鏡檢，根據(jù)形態(tài)和染色特點(diǎn)，可報告“找到革蘭氏×性菌，形似××菌”或報告“未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌”。涂片檢查包括涂片找細(xì)菌、淋球菌、酵母菌等。

　3.2、培養(yǎng) 普通細(xì)菌培養(yǎng)：標(biāo)本接種血平板、麥康凱平板各一只，35℃培養(yǎng) 18～24 小時，根據(jù)菌落特性和形態(tài)染色，進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，如培養(yǎng) 48 小時無菌生長，即報告“無細(xì)菌生長”。

　4、報告結(jié)果 4.1、涂片報告“找到革蘭氏×性菌”，淋球菌要報告在白細(xì)胞內(nèi)外是否發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性雙球菌。

　4.2、對正常無菌部位的感染，從膿汁或分泌物分離到細(xì)菌，均有臨床意義，按分離鑒定結(jié)果報告細(xì)菌名稱及藥敏試驗(yàn)。

　5、操作流程

　生殖系統(tǒng)標(biāo)本的處理

　1、生殖系統(tǒng)標(biāo)本培養(yǎng)的主要病原菌 革蘭陽性菌

　 革蘭陰性菌 葡萄球菌

　 淋病奈瑟菌 腸球菌

　 大腸埃希菌 化膿性鏈球菌

　 擬桿菌 厭氧鏈球菌

　 銅綠假單胞菌 結(jié)核分枝桿菌

　 變形桿菌 2、標(biāo)本收集：陰道、子宮頸及前列腺等分泌物應(yīng)由臨床醫(yī)師采集，收集于無菌試管內(nèi)送檢。

　3、涂片檢查 3.1、一般細(xì)菌、淋病奈瑟菌和杜克雷嗜血桿菌：革蘭染色鏡檢作初步報告。

　3.2、結(jié)核桿菌：抗酸染色鏡檢后作初步報告。

　4、檢驗(yàn)過程：用棉拭子劃完第一區(qū)后，用接種環(huán)繼續(xù)分區(qū)劃線，35℃普通培養(yǎng)箱孵育 18～24 小時，如有要求培養(yǎng)淋球菌和真菌則加種專用培養(yǎng)基。

　5、檢驗(yàn)流程

　 6、結(jié)果報告：報告細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

　抗菌藥物敏感試驗(yàn)

　若只根據(jù)是否出現(xiàn)抑菌環(huán)而不考慮抑菌環(huán)的直徑大小，來判斷細(xì)菌是否對抗菌藥物敏感的實(shí)驗(yàn)方法，其結(jié)果是不正確的。而紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)原理，根據(jù)抑菌環(huán)直徑大小與最低抑菌濃度的相關(guān)性，結(jié)合臨床上已知敏感或耐藥菌株的狀態(tài)，其結(jié)果是可靠的。WHO 推薦瓊脂擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)(改良 Kirby-Bauer 法)，簡稱 K-B 法，其目的在于技術(shù)的簡單和可重復(fù)性。本法特別適用于腸桿菌科細(xì)菌，也可用于快速生長的致病菌，但不適用于其他細(xì)菌，如嗜血桿菌、奈瑟菌、專性厭氧菌及酵母樣菌等。無論用哪種方法接種，只要質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)在預(yù)期范圍內(nèi)，均可按同一解釋標(biāo)準(zhǔn)報告結(jié)果。但并非從感染患者分離到的微生物都必須做敏感試驗(yàn)，對于污染、機(jī)體共生的正常細(xì)菌群和那些與感染無關(guān)的細(xì)菌，可不必做敏感試驗(yàn)，只有那些被認(rèn)為引起感染的微生物，應(yīng)先分純、鑒定菌種后再做敏感試驗(yàn)。

　1、試驗(yàn)用材料 1.1、培養(yǎng)基 Kirby-Bauer 法指定用 Mueller-Hinton 瓊脂。多年大量的有關(guān)敏感試驗(yàn)的方法學(xué)研究，均采用該培養(yǎng)基，維持細(xì)菌正常發(fā)育，絕大多數(shù)細(xì)菌在此培養(yǎng)基上生長良好。此培養(yǎng)基不拮抗抗菌藥物活性以及商品的批間差異等方面均優(yōu)于其他培養(yǎng)基。若檢測肺炎鏈球菌的敏感性時，在培養(yǎng)基中加 5％的脫纖維羊血，制成血平板。測嗜血桿菌及淋病奈瑟菌的敏感性時，在培養(yǎng)基中須加入 1％血紅素和 2.5mg/ml 輔酶 I 后應(yīng)校正 pH 7.2～7.4。

　制備 MH 瓊脂平板應(yīng)用直徑 90cm 平皿。在水平的實(shí)驗(yàn)臺上傾制。瓊脂厚為 4mm，允許誤差為土 lmm。瓊脂凝固后，應(yīng)測一下 pH 是否正確。瓊脂于板應(yīng)放 4℃保存，在 7 日內(nèi)用完。

　1.2、藥物紙片 抗菌藥物紙片直徑約為 6.00～6.35mm，每片的吸水量約 20μl。采用 K-B法，紙片的藥物含量必須與該法規(guī)定的一致，不得任意更改。藥物紙片可以購買，也可自制，用前必須做質(zhì)量鑒定。用以下兩個指標(biāo)判定紙片的質(zhì)量：

�、倨�間差：是衡量不同紙片含藥是否均一的指標(biāo)。測定方法：以質(zhì)控菌株

　接種 M-H 瓊脂平板，一塊平板上貼 6 張相同的紙片。

　35C 過夜，培養(yǎng)后，記錄 6 個抑菌直徑，其最大和最小之差不應(yīng)大于 1～2mm。

　②準(zhǔn)確度：判定紙片的實(shí)際含藥量與標(biāo)量是否一致。

　紙片的合理保存十分重要。藥物紙片必須...

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