云南復(fù)烤煙葉不同地點(diǎn)醇化過(guò)程中可培養(yǎng)真菌種群分析

　　摘要：為較全面的了解云南復(fù)烤煙葉在不同地點(diǎn)醇化過(guò)程中真菌多樣性，挖掘其中的有益微生物，提高煙草醇化品質(zhì)，以復(fù)烤煙葉為試驗(yàn)材料，利用18S rDNA克隆測(cè)序技術(shù)，系統(tǒng)研究了其醇化過(guò)程中可培養(yǎng)真菌的種群結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，醇化過(guò)程中，復(fù)烤煙葉葉面真菌數(shù)量除曲靖?jìng)}庫(kù)在6月有所上升外，其余各地均隨著醇化的進(jìn)行而逐漸下降，其中曲靖和楚雄兩地非常接近，元江最少；通過(guò)形態(tài)特征及18S rDNA鑒定，煙葉葉面真菌包括根霉屬真菌、青霉屬真菌、曲霉屬真菌等24個(gè)真菌屬（種）。不同地點(diǎn)，不同時(shí)期煙葉葉面真菌的數(shù)量、種類及優(yōu)勢(shì)種群不盡相同，而根霉屬真菌始終為優(yōu)勢(shì)種群。
　　關(guān)鍵詞：復(fù)烤煙葉；醇化；真菌：18S rDNA
　　煙葉是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的商品，是卷煙工業(yè)的主要原料。由于當(dāng)年復(fù)烤的煙葉存在刺激性大、青雜氣重、煙氣粗糙、余味澀口、香氣不夠顯露等特點(diǎn)，不適宜直接進(jìn)行卷煙生產(chǎn)，需經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的醇化來(lái)改善煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性及評(píng)吸質(zhì)量，從而達(dá)到生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。在煙葉醇化過(guò)程中，微生物及其產(chǎn)生的酶發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用微生物不僅可以通過(guò)自身的生命活動(dòng)作用于煙葉醇化過(guò)程，還可通過(guò)其代謝產(chǎn)生的生物酶參與煙葉的生理生化反應(yīng)，促進(jìn)煙葉中生物大分子的轉(zhuǎn)化。有研究表明，將微生物或酶用于煙葉醇化可縮短醇化時(shí)間，提高煙葉品質(zhì)和改善煙氣特性。相反，如果醇化過(guò)程中某類微生物過(guò)度繁殖，則會(huì)影響煙葉醇化品質(zhì)，后續(xù)的卷煙生產(chǎn)及質(zhì)量控制。因此，研究醇化過(guò)程中微生物的變化規(guī)律，對(duì)調(diào)控微生物作用，提高醇化效率，乃至揭示煙葉醇化機(jī)理具有重要意義。關(guān)于煙葉醇化過(guò)程中微生物變化已有不少研究，但關(guān)于復(fù)烤煙葉不同地點(diǎn)醇化其葉面微生物的變化卻鮮有報(bào)道。
　　云南是我國(guó)煙草原料大省，然而云南立體氣候特點(diǎn)明顯、不同地區(qū)生態(tài)條件差異顯著，勢(shì)必影響到微生物群落結(jié)構(gòu)差異，從而對(duì)煙葉醇化品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。但目前尚未見(jiàn)關(guān)于云南復(fù)烤煙葉不同地點(diǎn)醇化過(guò)程中葉面可培養(yǎng)真菌群落結(jié)構(gòu)的比較研究。基于此，本研究對(duì)置于彌勒、曲靖、元江、楚雄4地的紅花大金元復(fù)烤煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量、種類及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究煙葉醇化機(jī)理和人工調(diào)控?zé)熑~醇化進(jìn)程提供依據(jù)。
　　1材料與方法
　　1.1供試材料
　　本試驗(yàn)所用的煙葉為紅云紅河集團(tuán)及紅塔集團(tuán)2014年的紅花大金元復(fù)烤煙葉，共選取7個(gè)樣品進(jìn)行試驗(yàn)，分別為昆明WDB2F及WDC3F、曲靖WDC3F及WBBSF、紅河WDC3F及WBBSF、大理VC02S。
　　1.2醇化地點(diǎn)及氣候條件
　　所有供試紅花大金元（簡(jiǎn)稱紅大，HD）復(fù)烤煙葉樣品均分別入庫(kù)彌勒、曲靖、元江和楚雄4個(gè)倉(cāng)儲(chǔ)地。彌勒煙葉倉(cāng)庫(kù)的年平均氣溫19.8℃、濕度為73.3%，曲靖煙葉倉(cāng)庫(kù)的年平均氣溫19.8℃、濕度為58.2%，元江煙葉倉(cāng)庫(kù)的年平均氣溫24.36℃、濕度為65%，楚雄煙葉倉(cāng)庫(kù)的年平均氣溫20.5℃、濕度為59.6%。
　　1.3取樣及真菌分離
　　于2015年4、10月：2016年1、7、9月于每個(gè)醇化地同步采集自然醇化了0、6、9、15和17個(gè)月的煙草樣品，采用無(wú)菌袋（1500 g/袋）密封包裝，每地7個(gè)樣，共140個(gè)樣品，測(cè)定煙葉葉面真菌種類及數(shù)量。
　　在無(wú)菌條件下，從每個(gè)煙葉樣品中隨機(jī)選取50個(gè)煙葉片段，然后用無(wú)菌剪刀剪成1cmx1cm大小組織塊，并從中隨機(jī)取30個(gè)組織塊貼于PDA平板上（10個(gè)組織塊/平板，平板直徑為90mm），28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～55 d，隔天觀察，發(fā)現(xiàn)組織塊周圍有真菌長(zhǎng)出，則將其挑取并轉(zhuǎn)接到新鮮PDA平板上，純化后接于PDA斜面進(jìn)行分類、鑒定及保藏。
　　1.4菌株鑒定
　　1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、生長(zhǎng)速率、質(zhì)地和分泌物狀態(tài)與顏色等，將分離得到的真菌分為不同的形態(tài)類群（morphotype）之后，從各類群中隨機(jī)挑取3-5株接種于PDA平板上，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，通過(guò)對(duì)孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)與大小、產(chǎn)孢方式與產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征來(lái)確定菌株的分類地位。對(duì)于不產(chǎn)孢的菌株，則進(jìn)行促孢培養(yǎng)，產(chǎn)孢后按上述方法進(jìn)行鑒定。對(duì)于利用各種方法促孢后仍然不產(chǎn)孢的類群，則依據(jù)菌落質(zhì)地、顏色、生長(zhǎng)速率，菌絲顏色、粗細(xì)和結(jié)構(gòu)等特征劃分為不同的無(wú)孢類群組（mycelia sterile）。
　　1.4.2分子鑒定
　　對(duì)于那些不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢后仍不能確定其分類地位的菌株，則通過(guò)測(cè)定其18S rDNA序列，并與Genebank上的序列比對(duì)后，再結(jié)合其形態(tài)特征來(lái)確定其分類地位。具體做法為：將供試菌株從斜面轉(zhuǎn)接到PDA平板上進(jìn)行活化，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）提取菌株基因組DNA。隨后利用真菌ITS通用引物ITSl（5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，合格后送碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列與NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)覆蓋率和相似度并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定其分類地位。
　　2結(jié)果
　　2.1煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量及其動(dòng)態(tài)變化
　　從彌勒、曲靖、元江、楚雄4個(gè)醇化地、5個(gè)不同醇化時(shí)間點(diǎn)的140個(gè)煙葉樣品的4200個(gè)煙葉片段中，共分離得到1636株真菌，其在醇化過(guò)程中各醇化地的分布及變化見(jiàn)圖1。由圖1可知，煙葉經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的醇化后，除曲靖和楚雄兩地在醇化9個(gè)月后煙葉葉面真菌數(shù)量非常接近外，各醇化地?zé)熑~葉面真菌數(shù)量差異較大，但總體而言，在各個(gè)醇化時(shí)間點(diǎn)都是元江煙葉葉面的真菌數(shù)量低于其他3個(gè)醇化地（醇化17個(gè)月后略高于彌勒）。且除曲靖醇化煙葉葉面真菌數(shù)量在醇化6個(gè)月時(shí)有所上升外，各醇化地?zé)熑~葉面真菌的數(shù)量均隨著醇化時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。
　　2.2煙葉葉面可培養(yǎng)真菌種類及其動(dòng)態(tài)變化

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