基于入血成分的金鐵鎖藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

　　[摘要] 采用高效液相色譜法建立了金鐵鎖藥材中尿囊素的含量測(cè)定方法。金鐵鎖藥材經(jīng)乙醇提取后，取續(xù)濾液進(jìn)行分析。采用ZORBAX NH₂色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），檢測(cè)波長220 nm，柱溫40 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水（93∶7），流速1.0 mL·min^-1。結(jié)果表明，尿囊素線性關(guān)系良好，具有較好的精密度和重復(fù)性。在0.010 4 ～ 0.166 g·L^-1，尿囊素的線性相關(guān)系數(shù)R²=0.999 4（n=5）；RSD（n=6）小于2.1%；平均回收率為95.47%～ 100.9%。該方法具有良好的靈敏度、回收率和重復(fù)性，可為金鐵鎖藥材的質(zhì)量控制提供參考。
　　[關(guān)鍵詞] 金鐵鎖；入血活性成分；尿囊素；高效液相色譜
　　中藥是一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)體系，它對(duì)人體的作用通常也被認(rèn)為是多成分和多靶點(diǎn)綜合效應(yīng)的結(jié)果，因此中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定與西藥有著跟本的區(qū)別。目前，從化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的角度來制定中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法主要有色譜法、光譜法以及質(zhì)譜法等。然而不管選取哪種方法作為中藥材的質(zhì)量控制方法，都必須先選擇好合適的對(duì)照品。通常對(duì)照品的選擇大部分都是藥材中含量相對(duì)較大的特征化合物或者是有效成分。前者雖然是中藥材中所含有的主要化合物，但是并不一定是中藥材發(fā)揮藥效作用的化合物，因此選擇這樣的化合物作為指標(biāo)性化合物制定的中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能從根本上控制中藥材的質(zhì)量。后者是中藥材中具有一定生物活性的化合物，用它來制定中藥村的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有一定的理論意義和實(shí)踐意義。傳統(tǒng)中藥多為口服給藥，其有效物質(zhì)必須以血液為介質(zhì)輸送到靶點(diǎn)，從而產(chǎn)生作用，因而給藥后的血清才是真正起作用的“制劑”，血清中含有的成分才是中藥的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，入血后的活性成分才是真正的有效成分^[1-2]。
　　金鐵鎖Psammosilene tunicoides為石竹科金鐵鎖屬植物的干燥根，主要分布在貴州、云南、四川、西藏等中國西南地區(qū)，是我國西南地區(qū)特有的單屬種植物，也是貴州民間常用藥物，現(xiàn)已作為稀有瀕危物種列于《中國植物紅皮書》中，屬國家二級(jí)保護(hù)植物。金鐵鎖以根入藥，具有散瘀定痛、止血、消癰排膿之功，用于跌打損傷、風(fēng)濕痛、胃氣痛、創(chuàng)傷出血等的治療^[3-5]。
　　金鐵鎖被收錄于《中國藥典》2010年版中，但在該標(biāo)準(zhǔn)中沒有用其化學(xué)成分為指標(biāo)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)。本研究以金鐵鎖中的入血化學(xué)成分（尿囊素）為指標(biāo)，建立了金鐵鎖藥材中尿囊素HPLC含量測(cè)定方法，該方法的精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，回收率高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可為控制金鐵鎖藥材的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為以化學(xué)成分為指標(biāo)的中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。
　　1 材料
　　高效液相色譜儀Ultimate300高效液相色譜儀（包括四元泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器，柱溫箱），1/10萬電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），KQ5200E型超聲波清洗（昆明市超聲儀器有限公司）。
　　色譜乙腈；水（重蒸水，臨用前制備）；無水乙醇；尿囊素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，1501-200001）；金鐵鎖藥材經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定為金鐵鎖P. tunicoides（6個(gè)不同產(chǎn)地）。
　　2 方法與結(jié)果
　　2.1 樣品前處理
　　2.1.1 血漿樣品前處理 取干燥、粉碎后的金鐵鎖藥材2.0 g，用30 mL 20%乙醇進(jìn)行超聲提取2次，合并提取液，減壓濃縮回收溶劑后得金鐵鎖提取物。取適量金鐵鎖提取物用水溶解，配成濃度為20 g·L^-1的溶液，通過灌胃給藥方式給大鼠（210 g）金鐵鎖提取物水溶液3 mL，分別在10，30，60，120 min后對(duì)大鼠進(jìn)行采血，將血液離心后取上層血漿100 μL用乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻后離心，將上層清液于氮吹儀上吹干，取93%乙腈100 μL進(jìn)行溶解，離心后待測(cè)�？瞻籽獫{按同樣方法處理。
　　2.1.2 藥材前處理 取金鐵鎖藥材2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶或三角瓶中，加入20%乙醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，補(bǔ)重后取續(xù)濾液進(jìn)行測(cè)定。
　　2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
　　精密稱取適量尿囊素對(duì)照品1.66 mg，加20%乙醇制成每1 mL含0.166 mg的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，根據(jù)需要用20%乙醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，即用即配。
　　2.3 高效液相色譜條件
　　ZORBAX NH₂色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（93∶7）；流速1.0 mL·min^-1；檢測(cè)波長220 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。
　　2.4 入血實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　將處理好的血漿樣品經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定，通過尿囊素對(duì)照品及空白血漿樣品的高效液相色譜圖的比較，確定尿囊素為金鐵鎖藥材中的1個(gè)入血化學(xué)成分，其結(jié)果見圖1。
　　2.5 提取條件的選擇
　　分別采用回流和超聲2種提取方式進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)超聲提取效果較好。對(duì)不同濃度的乙醇以及溶劑用量、提取時(shí)間和次數(shù)進(jìn)行了考查，最終確定提取條件為30 mL 20%乙醇超聲提取40 min。
　　2.6 檢測(cè)波長的選擇
　　根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]以及多次實(shí)驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長為220 nm時(shí)效果較好。
　　2.7 柱溫的選擇
　　考察了不同柱溫對(duì)尿囊素分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫為40 ℃時(shí)，峰形較好，分離度較好。
　　2.8 線性關(guān)系的考察
　　精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的尿囊素1.66 mg于10 mL量瓶中，加20%乙醇配成0.166 g·L^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別制備得0.010 4，0.020 8，0.041 5，0.083，0.166 g·L^-1 5個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，分別精密吸取該對(duì)照品系列溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并以對(duì)照品的峰面積（X）為橫坐標(biāo)，濃度（g·L^-1）Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程Y=0.013 7X+0.001 2，R²=0.999 4（n=5），結(jié)果表明，尿囊素在0.104～1.66 mg線性關(guān)系良好。

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