柱前衍生化—高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定含油脂藥材中8種低分子羰基化合物

　　摘要：目的 建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定含油脂類藥材中低分子羰基化合物的方法。方法 苦杏仁等藥材經(jīng)水提取，在酸性條件下，經(jīng)2，4-二硝基苯肼（DNPH）衍生后，衍生物直接用HPLC測(cè)定。色譜柱：Kromasil KR100-5 C18 （250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：A為水-乙腈-四氫呋南-異丙醇（59∶30∶10∶1），B為水-乙腈（35∶65），梯度洗脫；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；柱溫：30 ℃。結(jié)果 甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生物在一定濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上，平均回收率為88.49%～93.65%，最低檢測(cè)限為0.002～0.008 ?g/mL。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性較好。
　　關(guān)鍵詞：柱前衍生化；低分子羰基化合物；高效液相色譜法；2，4-二硝基苯肼
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.017
　　中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2013）12-0046-03
　　1995年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）首次收載了酸敗度檢查法，此后歷版藥典均有收載[1-3]，其中羰基值測(cè)定的方法為比色法，測(cè)定原理為：在酸性條件下，羰基化合物與2，4-二硝基苯肼（DNPH）反應(yīng)，生成2，4-二硝基苯腙，再與氫氧化鉀作用，生成酒紅色共振型離子，在453 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度，計(jì)算出樣品中的羰基值。
　　比色法的準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性差，影響因素較多[4-5]，其中2，4-二硝基苯肼溶液加入量的準(zhǔn)確性、測(cè)定方法的反應(yīng)條件、所用試劑的雜質(zhì)等直接影響該方法的準(zhǔn)確性。另外，該方法使用溶劑量大，毒性大，且操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)等因素，不僅影響結(jié)果準(zhǔn)確性，且效率低下、不環(huán)保。本研究擬克服現(xiàn)有測(cè)定方法的弊端和不足，以建立客觀、專屬的測(cè)定方法，對(duì)羰基值測(cè)定方法
　　進(jìn)行探索研究�？紤]到酸敗的產(chǎn)物中主要生成低分子的醛類、酮類化合物，本研究建立含油脂類中藥材中甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、丁酮和丁醛等羰基化合物衍生物的高效液相色譜（HPLC）測(cè)定方法，為控制本類產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。
　　1 儀器與試藥
　　Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器（日本島津），XS205電子天平（梅特勒-托利多儀器有限責(zé)任公司），KQ-300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），TW20恒溫水浴鍋（Julabo儀器公司）。
　　乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物（批號(hào)189048，純度分別為99.9%、99.7%、98.0%、95.0%、99.9%、99.0%、99.0%、99.5%，上海安譜試劑公司）。
　　苦杏仁（批號(hào)130205）、炒苦杏仁（批號(hào)130214）、桃仁（批
　　號(hào)121220）、燀桃仁（批號(hào)130105），均購(gòu)自北京綠野飲片公司。經(jīng)鑒定，分別來(lái)源于薔薇科植物杏Prunus armeniaca L.及山桃Prunus davidiana （Carr.） Franch.的干燥成熟種子。
　　2 方法與結(jié)果
　　2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
　　色譜柱：Kromasil KR100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；以水-乙腈-四氫呋南-異丙醇（59∶30∶10∶1）為流動(dòng)相A，以水-乙腈（35∶65）為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；進(jìn)樣量10 ?L。在上述色譜條件下，各色譜峰分離良好，測(cè)定組分均能達(dá)到基線分離（見(jiàn)圖1）。
　　2.2 對(duì)照品溶液的制備
　　分別精密稱取甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生物對(duì)照品適量，加乙腈制成每1 mL各含0.02 mg的混合溶液，即得。
　　2.3 供試品溶液的制備
　　精密稱取藥材粉末15 g，精密稱定，加水30 mL，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）1 h，離心，精密吸取澄清液10 mL至25 mL具塞刻度管中，精密加入1 mL 3.0 g/L的DNPH溶液、4 mL醋酸鹽緩沖溶液（pH 4.8），加乙腈至刻度，在40 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱90 min，取出放至室溫，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
　　2.4 線性關(guān)系考察
　　分別精密稱取甲醛DNPH衍生物對(duì)照品50.67 mg、乙醛DNPH衍生物對(duì)照品49.12 mg、丙酮DNPH衍生物對(duì)照品49.60 mg、丙烯醛DNPH衍生物對(duì)照品49.14 mg、丙醛DNPH衍生物對(duì)照品49.14 mg、巴豆醛DNPH衍生物對(duì)照品51.18 mg、2-丁酮DNPH衍生物對(duì)照品48.91 mg，丁醛DNPH衍生物對(duì)照品49.20 mg，置100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取1.0 mL置25 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度。分別精密吸取此混合對(duì)照溶液1、2、5、10、15、20、30 ?L，注入高效液相色譜儀，按色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量（?g）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表2。
　　1.甲醛DNPH衍生物；2.乙醛DNPH衍生物；3.丙酮DNPH衍生物；
　　4.丙烯醛DNPH衍生物；5.丙醛DNPH衍生物；6.巴豆醛DNPH衍生物；
　　7.2-丁酮DNPH衍生物；8.丁醛DNPH衍生物
　　2.5 精密度試驗(yàn)
　　精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 ?L，測(cè)定各峰峰面積，計(jì)算得甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物RSD分別為0.07%、1.2%、0.26%、0.11%、0.48%、0.40%、1.9%、0.58%。

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