基于DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)聯(lián)用的藥材溯源新方法研究

　　[摘要] 利用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中ITS （internal transcribed spacer） 序列，結(jié)合產(chǎn)地分析和形態(tài)分析對(duì)新發(fā)現(xiàn)的一種黑果枸杞混偽品進(jìn)行溯源研究。通過(guò)提取樣品DNA，PCR擴(kuò)增及雙向測(cè)序，獲得樣品的ITS序列。所得序列用ContingExpress軟件進(jìn)行拼接，截取ITS序列全長(zhǎng);利用 NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的ITS序列進(jìn)行相似度分析對(duì)其進(jìn)行DNA條碼溯源;根據(jù)其產(chǎn)地分析DNA條形碼溯源結(jié)果;再根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，3種方法聯(lián)用獲得溯源結(jié)果。新發(fā)現(xiàn)的黑果枸杞混偽品來(lái)源于小檗科小檗屬植物喀什小檗Berberis kaschgarica。與黑果枸杞的主要區(qū)別：喀什小檗果實(shí)表面平滑，質(zhì)地輕脆，黑果枸杞表面皺縮，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)而硬;喀什小檗外果皮細(xì)胞壁連珠狀增厚，石細(xì)胞壁平直，層紋不明顯，黑果枸杞外果皮細(xì)胞壁不增厚，石細(xì)胞壁波浪狀，層紋明顯;喀什小檗的ITS序列長(zhǎng)度為606 bp，黑果枸杞的長(zhǎng)度為654 bp，二者序列對(duì)齊后的相似度為53.32%。
　　[關(guān)鍵詞] 黑果枸杞;混偽品;ITS 序列;溯源
　　[收稿日期] 2014-07-05
　　[基金項(xiàng)目] 國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2011DFA31370）
　　[通信作者] 劉春生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幱弥参飳W(xué)與分子生藥學(xué)，Tel：（010）84738624，E-mail：max_liucs@263.net
　　[作者簡(jiǎn)介] 顧選，碩士研究生，E-mail：guxuan123.love@163.com
　　傳統(tǒng)的藥材溯源方法是通過(guò)產(chǎn)地調(diào)研、標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)室植物分類鑒定等步驟進(jìn)行[1]，這種方法需要采集到植物完整標(biāo)本，尤其是花的標(biāo)本，溯源周期長(zhǎng)，不能滿足實(shí)際工作中的需要。DNA條形碼是一段短的DNA片段，能夠用于物種識(shí)別，其特點(diǎn)是不依賴于植物形態(tài)、不受生長(zhǎng)發(fā)育階段限制、不依賴于鑒定人員經(jīng)驗(yàn)，能夠鑒定無(wú)背景信息的藥用植物[2-4]。在DNA條形碼中，ITS （internal transcribed spacer） 序列的進(jìn)化速率適中且具有較高的物種分辨率[5]，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到中藥材的物種鑒定中[6-9]。但是，由于利用ITS序列進(jìn)行分子鑒定時(shí)還存在著相似度閾值等問(wèn)題，DNA條形碼分子鑒定還不能完全解決藥材溯源問(wèn)題;每種藥用植物都有其固定的產(chǎn)地，野生藥用植物產(chǎn)地尤其明確，產(chǎn)地信息對(duì)中藥材溯源也有重要作用;植物的部分信息，如果實(shí)形態(tài)、顏色等，在科屬確定的基礎(chǔ)上，對(duì)種的鑒別具有重要意義。本文基于以上思路，提出“DNA條形碼-產(chǎn)地-形態(tài)”聯(lián)用方法對(duì)中藥和民族藥材進(jìn)行溯源，彌補(bǔ)傳統(tǒng)溯源方法的缺點(diǎn)，為進(jìn)一步提高中藥材質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。
　　黑果枸杞為茄科植物黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.的干燥成熟果實(shí)[10]，具有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)肝明目，補(bǔ)血安神，生津止渴，潤(rùn)肺止咳、清熱除蒸、清肺降火、補(bǔ)虛等功效[11]。近年來(lái)，在黑果枸杞中發(fā)現(xiàn)了具有清除自由基及抗氧化、抗輻射功能的花青素[12-13]，導(dǎo)致黑果枸杞用量猛增，市場(chǎng)價(jià)格迅速上漲[14]。作者在對(duì)黑果枸杞市場(chǎng)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)中存在一種黑果枸杞，產(chǎn)地為新疆，但種子粒數(shù)和顯微結(jié)構(gòu)與黑果枸杞不同，這種黑果枸杞是產(chǎn)地變異還是其他物種無(wú)法確定，為保證黑果枸杞質(zhì)量，對(duì)其進(jìn)行品種溯源具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)擬采取DNA條形碼-產(chǎn)地-形態(tài)分析相結(jié)合的方法對(duì)黑果枸杞的這種疑似混偽品進(jìn)行溯源，為保證黑果枸杞質(zhì)量提供依據(jù)。
　　1 材料
　　黑果枸杞藥材3份，來(lái)源于青海格爾木，由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定。黑果枸杞的疑似偽品藥材3份，來(lái)源于新疆喀什市。6份樣品的憑證標(biāo)本均保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)標(biāo)本室。
　　2 方法
　　2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增方法
　　取樣品，觀察形態(tài)，形態(tài)結(jié)果一致。每份樣品取3粒果實(shí)進(jìn)行DNA提取。各份樣本分別用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉，采用植物DNA 提取試劑盒（北京博邁德生物有限公司）提取總DNA。采用ITS序列通用引物[6]在PCR擴(kuò)增儀（TProfessiona型，德國(guó)Biometra公司）上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：50 μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物P1和P4各加2.5 μL（5 μmol·L^-1），DNA 模板4 μL，ddH₂O 16 μL。PCR擴(kuò)增程序： 94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性1 min，55 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下檢視，均由上海生工生物工程有限公司測(cè)序部測(cè)序。各樣品均采用正向和反向測(cè)序，以保證測(cè)序的準(zhǔn)確性。
　　2.2 序列分析方法
　　利用 ContigExpress 軟件對(duì)測(cè)序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接，根據(jù) BLAST所獲相似度最高物種的ITS 序列邊界，截取待鑒定物種的ITS 序列，然后利用相似度法和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)法分析序列。
　　2.3 基于DNA條形碼的溯源方法
　　根據(jù)NCBI中BLAST功能，檢索NCBI中注冊(cè)的相似度最高的物種，按照相似度最高的物種截取ITS全長(zhǎng)。再利用樣品的ITS序列檢索，根據(jù)屬間差異為9.6%～28.8%、種間差異值為1.2%～10.2%的研究結(jié)果[15]，種內(nèi)的差異小于1%[16]，本文以相似度90%以上為屬的溯源依據(jù)，以相似度99%以上為物種溯源依據(jù)，獲得溯源結(jié)果。
　　2.4 基于產(chǎn)地分析的溯源方法
　　根據(jù)2.3項(xiàng)下獲得的科屬溯源結(jié)果，依據(jù)《新疆植物志》記載的新疆分布的該屬植物物種信息;在NCBI上下載這些物種的ITS序列，通過(guò)相似度法、聚類分析法和特異位點(diǎn)法確定物種，獲得物種的溯源結(jié)果。

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