中藥材川貝母的DNA分子標(biāo)記鑒定研究

　　摘要： 貝母為常用貴重中藥材，藥用歷史悠久，我國(guó)貝母屬植物已超過(guò)50種(變種)，全國(guó)各地用作貝母的原植物種類繁多，此外商品貝母中還常混有土貝母、唐菖蒲等偽品，嚴(yán)重影響了藥品的安全性和有效性，由于貝母類藥材的形態(tài)學(xué)上的差異較小，但是化學(xué)成分差異大，因此準(zhǔn)確地鑒定貝母類藥材的基源種類是一項(xiàng)極為重要的工作，為了探索貝母類藥材的快速、準(zhǔn)確的鑒別方法，運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定川貝母的真?zhèn)�，以克服目前僅依據(jù)形態(tài)、顯微特征及理化進(jìn)行鑒別的不足。
　　 關(guān)鍵詞： 川貝母；DNA；PCR 【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1672-8602(2014)03-0196-01
　　川貝母系百合科植物川貝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母Fritillaria przewalskii Maxim.、梭砂貝母Fritillaria delavayi Franch.、太白貝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis（S.Y.Tang et S.C.Yue）Z.D.Liu.S.Wang et S.C.Chen的干燥鱗莖。按性狀不同分別習(xí)稱"松貝"、"青貝"、"爐貝"和"栽培品"。川貝母性微寒而味甘苦，入心肺經(jīng)，能潤(rùn)肺、止咳、化痰，是一味珍貴的中藥材。"中國(guó)藥典"規(guī)定藥用川貝母為以上6個(gè)品種，但我國(guó)貝母屬植物已超過(guò)50種，造成貝母基源極為復(fù)雜，并且隨著需求量的增加，基源混亂的現(xiàn)象呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，直接影響川貝母臨床用藥的安全、療效。運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定川貝母的真?zhèn)�，以克服目前僅依據(jù)形態(tài)、顯微特征及理化進(jìn)行鑒別的不足。使中藥鑒定的手段從傳統(tǒng)的形態(tài)表征擴(kuò)展到了遺傳物質(zhì)DNA。特別是近年來(lái)微量DNA的PCR技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展，使分子生物學(xué)技術(shù)與方法以特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，微量、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于近緣種、珍稀種、破碎藥材等的鑒定。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)川貝母進(jìn)行了研究，建立了川貝母DNA分子標(biāo)記鑒定方法，為川貝母與其偽品的鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。
　　1 材料與儀器
　　 1.1 藥材:(1)伊貝母對(duì)照藥材、平貝母對(duì)照藥材、湖北貝母對(duì)照藥材、浙貝母對(duì)照藥材、川貝母對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所）。(2)青貝、爐貝、濃蜜貝母（廣西錦瑩藥業(yè)有限公司）。
　　 1.2 試藥: 新型植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；10×PCR緩沖液、二氯化鎂（25mmol/L）、dNTP（10mmol/L）、鑒別引物：5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ、無(wú)菌超純水、瓊脂糖、50×TAE電泳緩沖液、DNA分子量標(biāo)記物GM331（上海生工）；GelRed核酸凝膠染色劑（BIOTIUM）；高保真Taq DAN聚合酶（5U/μl）、10×酶切緩沖液、Sma I（10U/μl）（Fermentas）。
　　 1.3 儀器:H1850型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；K960型熱循環(huán)儀（杭州晶格儀器有限公司）；DYCP-31DN型電泳儀（北京六一儀器廠）；GSG-2000核酸/蛋白質(zhì)凝膠成像儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。
　　2 方法
　　 2.1 模板DNA提取:取本品0.1g，依次用75%乙醇1ml、滅菌超純水1ml清洗，吸干表面水分，置乳缽中研磨成極細(xì)粉。取20mg ，置1.5ml離心管中，用新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA[加入緩沖液AP1 400μl和RNA酶溶液（10mg/ml）4μl，渦漩振蕩，65℃水浴加熱10分鐘，加入緩沖液AP2 130μl，充分混勻，冰浴冷卻5分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘14000轉(zhuǎn)）10分鐘；吸取上清液轉(zhuǎn)移入另一離心管中，加入1.5倍體積的緩沖液AP3/E，混勻，加到吸附柱上，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn)）1分鐘，棄去過(guò)濾液，加入漂洗液700μl，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，棄去過(guò)濾液；再加入漂洗液500μl，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，棄去過(guò)濾液；再離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn)）2分鐘，取出吸附柱，放入另一離心管中，加入50μl洗脫緩沖液，室溫放置3～5分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）1分鐘,將洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）1分鐘]，取洗脫液，作為供試品溶液，置4℃冰箱中備用。另取川貝母對(duì)照藥材0.1g，同法制成對(duì)照藥材模板DNA溶液。
　　 2.2 PCR-RFLP反應(yīng):鑒別引物：5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ。PCR反應(yīng)體系：在200μl離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為30μl，反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液3μl，二氯化鎂（25mmol/L）2.4μl，dNTP（10mmol/L）0.6μl，鑒別引物（30μmol/L）各0.5μl，高保真Taq DAN聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板1μl，無(wú)菌超純水21.8μl。將離心管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性4分鐘，循環(huán)反應(yīng)30次（95℃ 30秒，55～58℃ 30秒，72℃ 30秒），72℃延伸5分鐘。取PCR反應(yīng)液，置500μl離心管中，進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)總體積為20μl，反應(yīng)體系包括10×酶切緩沖液2μl，PCR反應(yīng)液6μl，Sma I（10U/μl）0.5μl，無(wú)菌超純水11.5μl，酶切反應(yīng)在30℃水浴反應(yīng)2小時(shí)。另取無(wú)菌超純水，同法上述PCR-RFLP反應(yīng)操作，作為空白對(duì)照。
　　 2.3 電泳檢測(cè): 膠濃度為1.5%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed；供試品與對(duì)照藥材酶切反應(yīng)溶液的上樣量分別為8μl，DNA分子量標(biāo)記上樣量為1μl（0.5μg/μl）。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上檢視。
　　3 結(jié)果
　　
　　
　　
　　注：1伊貝母對(duì)照藥材、2平貝母對(duì)照藥材、3湖北貝母對(duì)照藥材、4浙貝母對(duì)照藥材、5川貝母對(duì)照藥材、6青貝、7爐貝、8濃蜜貝母、9空白、M分子量標(biāo)記物（100～600bp）。經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，青貝、爐貝與川貝母對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在100～250bp有兩條DNA條帶。伊貝母對(duì)照藥材、平貝母對(duì)照藥材、湖北貝母對(duì)照藥材、浙貝母對(duì)照藥材、濃蜜貝母與川貝母對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在100～250bp無(wú)DNA條帶。
　　4 討論
　　 由于本實(shí)驗(yàn)采用DNA吸附柱和新型獨(dú)特的溶液系統(tǒng)，適合于從含酚類、多糖類和酶抑制物的制物樣品中快速簡(jiǎn)單地提取基因組DNA。在此基礎(chǔ)上采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)對(duì)伊貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母、川貝母、青貝、爐貝、濃蜜貝母8種貝母進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果表明，只有青貝、爐貝與引物有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，不同產(chǎn)地的平貝母、、浙貝母、湖北貝母、伊貝母、濃蜜貝母與引物無(wú)特異性的結(jié)合位點(diǎn)。因此通過(guò)對(duì)8種貝母進(jìn)行PCR分析，川貝母與其他貝母的DNA分子差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較好，為進(jìn)一步發(fā)掘和充分利用貝母資源提供理論依據(jù)。

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