尹長城：現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)新的研究技術(shù)

　　北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)跨學(xué)科論壇

　　現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)新的研究技術(shù)

　　尹長城 教授

　　北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物物理系

　　英杰交流中心二層第一會議室

　　Cryo-electron Microscopy –An Emerging Technique in Structural Biology

　　Pro. Yin Chang-cheng

　　Department of Biophysics ,School of Basic Medical Sciences, Peking University

　　主持人講話:首先歡迎各位同學(xué)來參加我們今天的講座。我先向大家介紹一下北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)跨學(xué)科研究中心的情況，原北京大學(xué)于原北京醫(yī)科大學(xué)合并后，在韓啟德院士的積極倡導(dǎo)下，我們成立了北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)跨學(xué)科研究中心，招收跨專業(yè)的研究人才。韓校長相信，以兩校合并為契機，我們新的北京大學(xué)一定能發(fā)揮自身優(yōu)勢，在二十一世紀(jì)培養(yǎng)出新興學(xué)科領(lǐng)域的拔尖人才。從上個學(xué)期開始，我們舉辦了這個跨學(xué)科論壇，我們邀請的都是在各自領(lǐng)域作出一定成績的年輕學(xué)者來給大家作帶有科普性質(zhì)的報告，希望這些報告對我們這些未來的跨學(xué)科人才有所啟發(fā)。下面我們就歡迎醫(yī)學(xué)部生物物理系的尹長城教授開始他今天的報告。

　　尹長城:

　　很高興來到北大本部,與新一代的莘莘學(xué)子,未來的跨學(xué)科人才進行交流.我是最近剛從英國回到祖國.我在1990年出國,先在瑞士做了一年的訪問學(xué)者,然后在英國劍橋大學(xué)Medical Research Center醫(yī)學(xué)研究中心分子生物學(xué)實驗室獲得博士學(xué)位,又在英國做了兩屆博士后工作.最近看到國內(nèi)的形勢朝著越來越好的方向發(fā)展，我覺得大有用武之地，就決定回國發(fā)展。我在英國時是主要結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的工作，所用的手段就是今天介紹的冷凍電子顯微鏡。冷凍電子顯微鏡是一項新興技術(shù)，近幾年得到迅速的發(fā)展，在研究大分子方面發(fā)揮重要作用。所以如果大家對研究生物學(xué),生物大分子方面有興趣，就要用好此項技術(shù)。

　　首先我向大家簡單的介紹一下背景。

　　我們看一下什么是結(jié)構(gòu)生物學(xué)? 結(jié)構(gòu)生物學(xué)主要是用物理的手段,用X-射線晶體學(xué),核磁共振波譜學(xué),電鏡技術(shù)等物理學(xué)技術(shù)來研究生物大分子的功能和結(jié)構(gòu).來闡明這些大分子相互作用中的機制。大家可以看到在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中強調(diào)結(jié)構(gòu)和功能的研究技術(shù)，沒有這些技術(shù)，就沒有結(jié)構(gòu)生物學(xué)。

　　結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展經(jīng)過以下幾個階段:結(jié)構(gòu)生物學(xué)起源于上世紀(jì)五十年代眾所周知的 Waston Crick 發(fā)現(xiàn)了 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，建立DNA的雙螺旋模型。60年代 當(dāng)時的開文迪許實驗室的M.Perutz J.Kendrew 用X-射線晶體衍射技術(shù)獲得了球蛋白的結(jié)構(gòu).由于X射線晶體衍射技術(shù)的應(yīng)用，使我們可以在晶體水平研究大分子的結(jié)構(gòu)，在分子原子基礎(chǔ)上解釋了大分子.由于他們開創(chuàng)性的工作，Waston ,Crick獲得了1962年的諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎,M.Pertt和J.Kendrew獲得了同年的化學(xué)獎.從那時起，技術(shù)的發(fā)展就成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)展最重要的決定因素。60到70 年代,在同一實驗室的他們又發(fā)展了電子晶體學(xué)技術(shù) ，當(dāng)時的研究對象主要是有序的,對稱性高的生物體系，如二維的晶體和對稱性很高的三維晶體。

70-80年代 ，多維核磁共振波譜學(xué)的發(fā)明使得在水溶液中研究生物大分子成為可能,水溶液中的生物大分子更接近于生理狀態(tài).最近二十年，80年代到本世紀(jì)初,冷凍電子顯微鏡的發(fā)明,這種技術(shù)的發(fā)明使我們不僅能夠研究生物大分子在晶體狀態(tài)和溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，而且能夠研究研究復(fù)雜 的大分子體系(molecular complex)超分子體系，這就是細胞器和細胞.可見結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展過程經(jīng)歷了從結(jié)晶到溶液再到大分子體系,超分子體系,如核糖體(ribosome),病毒,溶酶體(lysosome),線粒體等.

　　 為什么要研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)?首先:結(jié)構(gòu)決定功能，說到底就是一個分子的三維結(jié)構(gòu)決定功能 ，因此如果要了解一個分子的功能首先要知道三維結(jié)構(gòu).人類基因組計劃(Human Genome Plan, HGP )完成后,為我們提供了大量的基因組序列。但是基因只給出了一個線性的序列,一個脫氧核苷酸的序列，是一個間接的信息；
而要知道更進一步的信息，必須要測定蛋白質(zhì).這就像在一個電話本上,你只能夠找到人的電話號碼,但這個人的職業(yè)身份外觀和其他具體情況是不能知道的.基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄,翻譯成蛋白質(zhì), 再經(jīng)過翻譯后的磷酸化,糖基化等修飾,蛋白質(zhì)折疊,多亞基,多復(fù)合體還要進行組裝,最后才能形成有功能的單位.(gene --transcription- translation —processing —folding —assembling —function unit)所以這些信息這樣一系列的過程是不可能只從單一的基因序列中得到，必須研究這些過程中分子的結(jié)構(gòu)和這些大分子的相互作用，到底是發(fā)生了什么變化，這些都要用到結(jié)構(gòu)生物學(xué)。另外，結(jié)構(gòu)是進行其他很多研究的基礎(chǔ):藥物設(shè)計,基因修飾,疫苗研制,人工蛋白質(zhì)構(gòu)建等。比如知道了一個蛋白的結(jié)構(gòu)，你就可以根據(jù)它的結(jié)構(gòu)特性來設(shè)計藥物，作為受體，讓一個小分子特異性的與它相結(jié)合，這是單個DNA序列不可能完成的。當(dāng)然知道了它的結(jié)構(gòu)，它的活性部位，酶活性中心就可以得知，比如得知離子通道的氨基酸組成，就可以進一步研究通道開關(guān)過程中蛋白的具體變化。

對病毒來說,如果知道它的結(jié)構(gòu),知道它在感染細胞的時候與細胞作用的氨基酸，可以根據(jù)病毒的結(jié)構(gòu)來設(shè)計一些治療的藥物。另外你知道了氨基酸的組成，知道具體氨基酸在蛋白中發(fā)揮的具體作用，就可以設(shè)計出新型的蛋白質(zhì)， 具有新性能，比如原來的蛋白不穩(wěn)定，設(shè)計的新型蛋白就可以提高它的穩(wěn)定性,且可以維持蛋白原有活性。

　　 剛才講到在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中重要的一個工具就是物理學(xué)手段.今天我就來介紹這些物理學(xué)手段同時比較這些方法的優(yōu)缺點.首先我們來看X-射線晶體學(xué)技術(shù)，這是唯一能給出高分辨率的技術(shù),他可以分辨到一個原子水平，這是X-射線晶體學(xué)的優(yōu)點，現(xiàn)在測定一個大分子，最基礎(chǔ)的根據(jù)就是X－射線晶體學(xué)；
它的缺點是首先要拿到晶體,但是不是所有的生物大分子都能夠獲得晶體，有些大分子的復(fù)合物晶體獲得比較困難,所以有些大分子達不到測定的要求；
其次分子在晶體中往往是被鎖定于某一狀態(tài),晶體培養(yǎng)的時間較長,所得到的晶體往往是分子處于基態(tài),而分子功能的行使多發(fā)生在激發(fā)態(tài),過渡態(tài)，X－射線晶體技術(shù)很難捕捉的分子的功能狀態(tài)。

　　核磁共振衍射技術(shù)同樣具有高分辨率的特點,僅次于X-射線晶體學(xué)技術(shù),另外可以在溶液中操作,接近生理狀態(tài),缺點是所作樣品的分子量要比較小,一般 在50KD以下,而且分子量越大所測到的譜線就越多，有時各譜線很難分辨，所以有時波譜不容易分辨.當(dāng)然隨著超導(dǎo)磁鐵的發(fā)展,有可能分子量向大分子挺進，但還是有一定限制。另外核磁共振衍射技術(shù)的反應(yīng)體系是溶液,這對不溶的蛋白比較困難,如膜蛋白,很難溶解，需要用去垢劑才可溶解,這就使研究復(fù)雜化。在核磁共振衍射的觀察中,去垢劑會造成很大的噪音和假相.

　　與前兩種技術(shù)不同，以上兩種方法都是間接觀察,都是利用衍射譜.而冷凍電子顯微鏡是直接觀察生物大分子,是直接看到分子，因此這樣的性質(zhì)就決定分子越大反而越好，越利于觀察,因此原則上來講用冷凍電子顯微鏡觀察分子，分子的大小沒有上限,可用于復(fù)雜大分子,超分子體系。另外由于這種技術(shù)的特點，它可以捕捉到活化的過渡狀態(tài)，可以研究分子的功能狀態(tài).另外適于薄體系,二維平面。冷凍電子顯微鏡最大的缺點是低分辨率,最高只達到3埃米,這是很難達到的,而X-射線晶體學(xué)技術(shù)分辨率是1埃米,核磁共振衍射技術(shù)分辨率是2埃米.

　　提到冷凍電子顯微鏡，先介紹一下電子顯微鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的發(fā)展。最先應(yīng)用于研究大分子是起先于1950年。二十世紀(jì)五十年代,發(fā)明負染技術(shù),這種技術(shù)由于染料的顆粒比較大，染料不浸透樣品而是堆積在樣品表面,所以觀察到的不是分子本身而是外貌，因此它的分辨率限制在2納米.到了六十年代,劍橋大學(xué)的科學(xué)家發(fā)展了用電鏡來解釋結(jié)構(gòu)的理論，提出三維重構(gòu)理論,用于研究病毒,由于這一項開創(chuàng)性研究，他獲得了1982年的諾貝爾化學(xué)獎。七十年代,同一個實驗室的科學(xué)家們在三維結(jié)構(gòu)理論的基礎(chǔ)上創(chuàng)立了生物電子晶體學(xué)理論，利用生物電子晶體學(xué)，他們就可以研究二維的高度有序的大分子 ，如二維結(jié)晶，分辨率達到0.7納米。

到了八十年代,快速冷凍技術(shù)的發(fā)明使分辨率提高到0.3納米,這個技術(shù)的發(fā)明導(dǎo)致的現(xiàn)在的電子顯微鏡的方面�？蓪�氨基酸基團在空間定位,進行大概的結(jié)構(gòu)解析.八十年代到本世紀(jì)初,利用計算機迅速發(fā)展的契機，發(fā)展圖象處理技術(shù),可應(yīng)用于研究不是非常有序非結(jié)晶的生物體，大大提高了我們的研究進程。

　　說了半天，到底什么是冷凍電子顯微鏡?冷凍電子顯微鏡本質(zhì)上還是電子顯微鏡，特殊的地方在于冷凍,就是在處理樣品時,對樣品進行快速冷凍.我們知道用水緩慢冷凍,會產(chǎn)生結(jié)晶,而快速冷凍,水就來不及結(jié)晶，會產(chǎn)生一種無序化的玻璃化狀態(tài),生物大分子被固定在這種無序的玻璃化狀態(tài)，即保持在某種天然狀態(tài).由于是生物樣品處于冷凍狀態(tài),所以必須用低溫觀察以保持,一般用低于液氮的溫度(-160攝氏度).然后記錄觀察晶體的圖象，記錄的圖象實際是分子二維的投影,不是分子三維結(jié)構(gòu)，通過計算機圖象處理,得到分子三維結(jié)構(gòu),繼而根據(jù)結(jié)構(gòu)進行分析功能,比如對于一個抗體，可知抗體與抗原的結(jié)合的部位,觀察結(jié)合后發(fā)生的變化.

　　冷凍電子顯微鏡是如何捕捉狀態(tài)的?實際操作就是要用樣品鉗,在銅網(wǎng)上加樣品,將多余的；
液體吸去，由于表面張力形成一層薄膜，同時將樣品放到低溫的液體中比液氮還低的乙烷，溫度是-150攝氏度,然后液化，固化，樣品固定進行低溫觀察。

　　為什么使用冷凍電子顯微鏡? 冷凍電子顯微鏡的顯著優(yōu)點在于將樣品保持在水相,保持天然狀態(tài),第二點就是可以得到高分辨率結(jié)構(gòu);另外由于這種技術(shù)的引進，可將分子在不同狀態(tài)下凍結(jié),可以捕捉到過渡態(tài)，基態(tài)過渡態(tài)均可觀察; 另外這種技術(shù)可用于觀察超分子體系.

　　剛才說了在電鏡中所觀察到的不是分子的三維結(jié)構(gòu)，而是分子三維結(jié)構(gòu)在二維平面上的投影，作怎樣從投影反推回來算出它的三維結(jié)構(gòu)呢？這就是三維重構(gòu)理論。三維重構(gòu)理論運用的數(shù)學(xué)原理：將一個密度函數(shù)進行三維傅立葉變換，密度函數(shù)就變?yōu)轭l率函數(shù)。這樣一個三維信息就壓縮到一個二維平面上,這就是電鏡照片的情況。取一個中心截面,那么一個投影的富氏變換就相當(dāng)于一個三維富氏變換的中心截面。根據(jù)這樣的原理，就可以根據(jù)投影得到的信息通過三維變換來算出分子在的結(jié)構(gòu)。比如,分子在溶液中不同的取向,分子直立或躺倒的狀態(tài)，在電鏡觀察時，投影是不一樣的，然后將投影進行傅立葉變換，理論上說,如果得到足夠多的投影,就是得到分子在所有方向上的投影,然后進行富氏變換,就可得到三維結(jié)構(gòu).這就是三維重構(gòu)的具體原理。根據(jù)樣品臺的特點，在實際操作中有不同的方法。對于二維結(jié)構(gòu),怎么得到不同的截面呢？可以從水平開始,傾斜不同角度,以得到投影。這樣的技術(shù)存在一個問題：由于樣品臺傾斜角度的限制,只能在0-70度之間轉(zhuǎn)動,不可能從0度傾斜到90度，所以70-90度之間沒有信息,這就是一個視錐問題,分辨率只有3-5埃米.第二種情況就是對于在溶液中的分子,分子取向是隨機分布的,所以只要分子數(shù)量足夠多,所觀察的現(xiàn)象就可得到在不同方向上的投影,也不必旋轉(zhuǎn)載物臺,不必傾斜角度.以上二維結(jié)構(gòu)和溶液中分子的觀察,都是疊加后取平均分布結(jié)果.還有一種情況就是對于大的物體,如細胞器,細胞,由于存在個體差異,不可能用平均分布,這時就要攝取一個細胞進行照相,進行不同角度傾斜,同樣由于視錐問題,70-90度之間沒有數(shù)據(jù).

　　最后來介紹一下冷凍電子顯微鏡的具體應(yīng)用:首先冷凍電子顯微鏡應(yīng)用于難以用X-射線晶體學(xué)技術(shù)和核磁共振衍射技術(shù)研究的大分子.比如一些纖維狀的堆積體,我們知道朊蛋白(prion)是導(dǎo)致瘋牛病(mad cow disease)的分子,這種蛋白的晶體很難幾乎不可能培養(yǎng),也很難獲得均勻的溶液.這樣的分子恰好可以用冷凍電子顯微鏡技術(shù)來研究。再如,對早老性癡呆癥(alzheimer’s disease)患者體內(nèi)淀粉樣蛋白(beta-amyloid)沉積的結(jié)構(gòu)研究，(點擊此處閱讀下一頁)

　　它就是一種纖維狀堆積體,在去年分子生物學(xué)雜志(journal of molecular biology)發(fā)表的一篇文章:先用圖象記錄,獲取纖維,看到4.8埃米的規(guī)則間隔,可見冷凍電子顯微鏡可以很好的保存樣品的精細結(jié)構(gòu).然后用富氏變換,通過光學(xué)衍射得到圖譜,發(fā)現(xiàn)beta-amyloid在4.76埃米處有一個強點,在9.6埃米處也有一個強點,而4.76埃米恰好是一個beta片層的厚度,這表明該蛋白以beta片層為一個重復(fù)周期,而9.6埃米是兩個beta片層反平行排列的厚度,隨后經(jīng)過重構(gòu)圖象根據(jù)間隔來判斷該蛋白是由beta片層組成反平行排列的纖維狀蛋白.不僅是一些不溶的纖維可以用于冷凍電子顯微鏡的研究，某些可溶性的蛋白,在某些條件下也會變成不溶狀態(tài),如胰島素(insulin)通常情況下是可溶,但也可形成纖維狀聚集物.用酸處理,胰島素會變成螺旋狀纖維聚積物,經(jīng)冷凍電子顯微鏡等觀察發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)是由beta片層組成一根纖維,然后相互纏繞而成螺旋狀.為什么經(jīng)酸處理,胰島素從可溶狀態(tài)變成不可溶?這是因為胰島素的雙鏈在酸性條件下，即ph值小于七的情況下,構(gòu)象發(fā)生變化,從有序變?yōu)闊o序狀態(tài),經(jīng)過重折疊,兩條鏈變?yōu)閎eta片層的反平行結(jié)構(gòu).

　　第二個應(yīng)用就是 冷凍電子顯微鏡可用于觀察分子,物質(zhì)的不同功能狀態(tài)，研究不同的功能蛋白.如離子通道的開放和關(guān)閉,開關(guān)的瞬間停留的非常短,如乙酰膽堿的受體,阿爾法螺旋發(fā)生順時旋轉(zhuǎn)開關(guān)從關(guān)閉到開放，加入乙酰膽堿以后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變.如肌肉收縮,加入ADP,肌肉束水平發(fā)生向上的三十度的旋轉(zhuǎn),這樣一個轉(zhuǎn)變使肌肉發(fā)生運動，這就是肌肉收縮的分子機制.大家學(xué)過生物化學(xué)都知道，蛋白合成循環(huán),生化學(xué)家只是對生物化學(xué)機制進行研究,那么結(jié)構(gòu)生物學(xué)家就希望能看到這種循環(huán),實際上是怎樣發(fā)生的。將核糖體(ribosome),信使RNA(Mrna),轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)和多肽，然后進行研究，發(fā)現(xiàn)實際的情況與生物化學(xué)學(xué)家得到的結(jié)論是吻合的，這就從結(jié)構(gòu)上證明生物化學(xué)家得到的結(jié)論是正確的。而且可以具體觀察到，在蛋白質(zhì)合成的過程中，每一步的具體過程，如核糖體是如何與信使RNA作用的。

　　第三方面的應(yīng)用就是冷凍電子顯微鏡可以為大分子測定提供初始模型。比如最近對核糖體的結(jié)構(gòu)解析,開始先用冷凍電子顯微鏡觀察,只達到20埃米的程度；
后來用X-射線晶體學(xué)技術(shù),這只能是衍射,只得到振幅,而沒有相位信息,只能引進重金屬獲得,但核糖體這種大分子太大,引進幾個重金屬作用不大.后來將冷凍電子顯微鏡與X-射線晶體學(xué)技術(shù)結(jié)合起來,利用冷凍電子顯微鏡得到的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將它引入到X－射線衍射技術(shù)中，利用相位與振幅信息相結(jié)合，可以得到7.8埃米的分辨率；
2001年,分辨率已提高至5.5埃米,可就可以研究各組分的分布和相互作用.

　　最后就是對復(fù)雜體系的研究:如噬菌體(phage)侵染細胞時的打孔裝置,十分復(fù)雜,幾乎不可能獲得晶體而且太大不能用核磁共振來研究,所以將各組分提取,分別用X-射線晶體學(xué)技術(shù)等獲得單個組分的結(jié)構(gòu),采取個個擊破的方法,再用冷凍電子顯微鏡重新組合,這一結(jié)果發(fā)表在今年的<自然>(nature)上.打孔裝置接觸細胞的一端是beta片層管狀結(jié)構(gòu),DNA通過管子進入細胞.再如,對病毒與受體相互作用的研究,結(jié)晶是不可能的, 冷凍電子顯微鏡對復(fù)合物觀察,發(fā)現(xiàn)受體有三個結(jié)構(gòu)域,細胞用一號結(jié)構(gòu)域域病毒作用,這對藥物設(shè)計有指導(dǎo)作用.

　　以上就是介紹冷凍電子顯微鏡的應(yīng)用與現(xiàn)狀，最后介紹一下未來的發(fā)展方向:我們知道人類基因組計劃完成,大家就想向研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)方面進軍,在這樣一個過程中冷凍電子顯微鏡起什么樣的作用呢？冷凍電子顯微鏡與X-射線晶體學(xué)技術(shù),核磁共振衍射技術(shù)結(jié)合,就可以解析復(fù)雜體系結(jié)構(gòu).因為X-射線晶體學(xué)技術(shù),核磁共振衍射技術(shù)只能對單個組分進行解析,要想得到復(fù)雜分子超分子體系的結(jié)構(gòu)，冷凍電子顯微鏡可以繪出密度圖，進行整合。這是未來結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方向。另外一個發(fā)展方向是與生物信息學(xué)的結(jié)合，可將特異性折疊建立數(shù)據(jù)庫,然后一個復(fù)雜體系的結(jié)構(gòu)就可利用數(shù)據(jù)庫對冷凍電子顯微鏡觀察得到的形態(tài)進行分析，可將結(jié)構(gòu)域的信息放到大分子體系中。最后，看到分子在細胞中的實際工作,這是生物學(xué)家的一個夢想,用 X-射線晶體學(xué)技術(shù),核磁共振衍射技術(shù)能看到分子，但只能在體外觀察,體內(nèi)的狀態(tài)無法觀察。而冷凍電子顯微鏡直接觀察,使這一夢想有可能實現(xiàn),以分子特定結(jié)構(gòu)為標(biāo)記(signature)進行動態(tài)時空觀察研究作用功能.

　　提問:

　　 問題:尹老師您好，質(zhì)譜質(zhì)譜連用技術(shù)也是目前在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方面的常用技術(shù)，您覺得它與冷凍電子顯微鏡技術(shù)的比較如何？

　　答：質(zhì)譜質(zhì)譜連用技術(shù)是將分子打成小片段,結(jié)構(gòu)已知然后組合.適用于分子,單個亞基；
然而對于復(fù)雜體系不適用.

　　問題:您能簡單介紹一下冷凍電子顯微鏡在國際上的應(yīng)用情況嗎？

　　答：因為時間倉促,在剛才沒有來得及介紹 .在國際上冷凍電子顯微鏡的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛。在歐洲,劍橋大學(xué)的MRC分子生物學(xué)實驗室，英國牛津大學(xué)，帝國理工大學(xué)，歐洲分子生物學(xué)研究所多有冷凍電子顯微鏡的設(shè)備。在美國有國立衛(wèi)生研究院，BERKLEY國家實驗室，BAYLAR醫(yī)學(xué)院，PURDUE大學(xué)也有。那么大家一定要問，為什么象哈佛，耶魯，普林斯頓這樣的一流大學(xué)沒有建立冷凍電子顯微鏡的實驗室，那時因為當(dāng)時他們沒有預(yù)見到這項技術(shù)的重要性和發(fā)展之快。國內(nèi)北京大學(xué)，清華大學(xué)，中國科學(xué)院生物物理所，國家電鏡實驗室都準(zhǔn)備和正在建立這樣的實驗室，我回國的目的就是要在國內(nèi)建立冷凍電子顯微鏡的實驗室。清華大學(xué)和中國科學(xué)院的生物物理所都已經(jīng)先后購買了冷凍電子顯微鏡，但目前在國內(nèi)還沒有一家單位能獨立開展自己的工作，有的只是我們北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院與國外進行合作研究。

　　問題：冷凍電子顯微鏡與以前我們所說的冷凍蝕刻技術(shù)有什么區(qū)別和聯(lián)系？

　　 答：冷凍蝕刻技術(shù)是將樣品進行固定，然后用刀切割，研究膜蛋白。所得到的是所研究物體的表面形態(tài)，由于它的顆粒比較粗，所以只能觀察物體的表面形態(tài)，而不能到原則水平。而冷凍電子顯微鏡技術(shù)由于固定方法特殊，固定于玻璃狀態(tài)，不引入人工效應(yīng)，且切片的厚度有問題。這種方法不要用染色，可以看到分子原子的狀態(tài)。

　　問題：我想問一個關(guān)于構(gòu)象的問題。如果是球形蛋白，有一個凹洞，如果投影，會不會有影響對其形態(tài)觀察的可信度？

　　答：這位同學(xué)可能沒有完全理會我的報告，將三維信息壓縮至二維，不只是一個切面，不是信息的丟失。而且我們這在努力提高冷凍電子顯微鏡的分辨率：分辨率如果達到3埃米，就可以對基團進行空間定位，分辨率如果達到2埃米，可以看到碳原子，氧原子，可對重原子進行空間定位，如果達到1埃米甚至可以看到氫原子，可以對輕原子進行空間定位

　　 問題：要進行動態(tài)觀察時如何做呢？

　　答：冷凍電子顯微鏡技術(shù)不可能用于連續(xù)觀察，只能是捕捉點的狀態(tài)，連續(xù)的動態(tài)觀察最有效的還是核磁共振衍射技術(shù)，因為是在溶液中觀察。

　　問題：您剛才提到了視錐問題，為解決70-90度不能觀察的視錐問題，可否讓鏡子轉(zhuǎn)？

　　答：讓電子源來旋轉(zhuǎn)。理論上可能，但在實際中是不行的，電子源激發(fā)路徑很長，不易控制， 但樣品容易控制，用計算機就可以很好的監(jiān)控。

　　問題：對分子的適時監(jiān)控目前的辦法是什么？

　　答：要研究分子在細胞中的功能，X-射線晶體學(xué)技術(shù)要獲得結(jié)晶，核磁共振衍射技術(shù)要有水溶液體系，這兩項技術(shù)都不可能。目前只能觀察，用冷凍電子顯微鏡這一個辦法，也可用光鏡，但應(yīng)為可見光的波長有限，需要標(biāo)記，只能看路徑，冷凍電子顯微鏡可用來看結(jié)構(gòu)變化。目前電鏡要求高真空，必須固定，所以不可能看連續(xù)的動態(tài)，只能選不同的時間點固定，比如說幾毫秒固定一次，在來模擬推測它的連續(xù)變換。

　　問題：冷凍電子顯微鏡與掃描電鏡的區(qū)別在何處？

　　答：冷凍電鏡是透射電鏡，看物體內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)；
而掃描電鏡是利用探針掃描，對大分子不能掃到分子內(nèi)部，而是表面形貌，不可能是分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。如果是研究原子水平，沒有問題。但一旦涉及到大分子，就要出現(xiàn)問題了。

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