貝類血細(xì)胞分類及其功能研究進(jìn)展

　　血細(xì)胞是貝類細(xì)胞免疫的承擔(dān)者，直接參與異物的吞噬、包囊、免疫黏附、傷口修復(fù)等過(guò)程[1]，同時(shí)能夠合成和釋放多種水解酶、抗菌肽、細(xì)胞因子類似物、調(diào)理素、凝集素等免疫因子，是體液免疫的供給者[2]。
　　關(guān)于貝類血細(xì)胞的研究開(kāi)始于1934年，興盛在上世紀(jì)70年代中期，主要研究血細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能，了解貝類的防御機(jī)制，以便抵御當(dāng)時(shí)寄生蟲(chóng)和病菌泛濫引起的大量死亡情況[3]。隨著研究的深入，學(xué)者們所用方法不同導(dǎo)致血細(xì)胞的分類命名存在巨大的差異，目前為止，貝類的血細(xì)胞分類都沒(méi)有形成一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本文通過(guò)引用國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)目前研究貝類血細(xì)胞分類的幾種技術(shù)方法做出闡述，列舉出一些常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)貝類血細(xì)胞的種類名稱，并簡(jiǎn)單介紹其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能，為以后貝類非特異性免疫防御相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。
　　1 貝類血細(xì)胞分類研究技術(shù)
　　早期的貝類血細(xì)胞分類研究主要是通過(guò)光學(xué)或電子顯微鏡的直接觀察，根據(jù)血細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器的形態(tài)、顆粒物質(zhì)的有無(wú)以及細(xì)胞外部的形態(tài)結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)方式、血細(xì)胞發(fā)生等來(lái)進(jìn)行分類。隨著組織化學(xué)染色方法的成熟和發(fā)展，由于血細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)對(duì)染色劑的親和性不同而呈現(xiàn)顏色上的差異，為血細(xì)胞分類提供了新的研究方法。近些年來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)、單克隆抗體及密度梯度離心等新型技術(shù)的應(yīng)用為貝類血細(xì)胞的分類提供更多選擇。
　　1.1 顯微鏡觀察技術(shù)
　　顯微鏡觀察技術(shù)分為普通光學(xué)顯微鏡觀察和電子顯微鏡觀察。其中，電子顯微鏡觀察又分為透射電鏡觀察和掃描電鏡觀察。與光學(xué)顯微鏡相比，電子顯微鏡是以電子束作為照明源對(duì)樣品進(jìn)行透射或反射，在通過(guò)電磁透鏡的多級(jí)放大后成像于熒光屏上。
　　透射電鏡具有高分辨率、高放大倍數(shù)、成像立體豐富等優(yōu)點(diǎn)，但由于其成像原理也存在樣品制備具有破壞性、電子束直接轟擊樣品表面、需真空環(huán)境及采樣率低等缺點(diǎn)。透射電鏡觀察貝類血細(xì)胞這種細(xì)胞密度低、易凝集、形態(tài)結(jié)構(gòu)多樣的懸浮游離細(xì)胞時(shí)，常規(guī)的樣品制備條件就不太適合。劉靜等[4]從取樣方法、瓊脂包埋方式和鋨酸固定時(shí)間等方面找到了適合菲律賓蛤仔血細(xì)胞透射電鏡的樣品制備方法，指出用固定液潤(rùn)洗過(guò)的注射器收取血淋巴液能有效防止凝集顯現(xiàn)產(chǎn)生，同時(shí)采用離心式的瓊脂包埋方法能最大限度地減少血細(xì)胞的丟失，并且鋨酸固定2 h得到的樣品制備效果最佳。
　　掃描電鏡分辨率高、觀察景深大，可直接觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)，圖像富有立體感、真實(shí)感，除了能顯示一半樣品表面的形貌外，還能將樣品微區(qū)范圍內(nèi)的化學(xué)元素與光、電、磁等性質(zhì)的差異以二維圖像形式顯示出來(lái)，并可用照相方式拍攝圖像[5]。
　　總之，透射電鏡常用于觀察普通顯微鏡不能分辨的細(xì)微結(jié)構(gòu)，掃描電鏡則主要用于觀察物體表面的形貌特征。有時(shí)兩者配合可以得到較為全面的分析結(jié)果。
　　1.2 組織化學(xué)染色技術(shù)
　　組織化學(xué)染色技術(shù)是利用一些特殊的染色物質(zhì)可與細(xì)胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而特異性附著顏色的原理，對(duì)這種成分進(jìn)行定性和定位分析的技術(shù)[3]。此方法可以通過(guò)選擇不同的染色劑幾乎可以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)各種成分，如：AB-PAS染色法可以顯示糖類；汞溴酚藍(lán)染色法可以顯示蛋白質(zhì)；蘇丹黑B染色法可以顯示脂肪類；Feulgen染色法顯示DNA等等。
　　1.3 流式細(xì)胞技術(shù)
　　流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速定性、定量分析或分選的技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、測(cè)量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點(diǎn)，已經(jīng)成為近代科學(xué)研究中的熱門(mén)[6]。流式細(xì)胞儀是以流式細(xì)胞術(shù)為核心技術(shù)，將經(jīng)過(guò)熒光染色的待測(cè)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，在鞘液的包被下單行排列，以激光束作為激發(fā)光源垂直照射單行流動(dòng)的細(xì)胞，對(duì)它的散射光和攜帶的熒光進(jìn)行探測(cè)，從而完成細(xì)胞分析和分選。
　　1.4 單克隆抗體技術(shù)
　　單克隆抗體技術(shù)是依據(jù)抗原抗體具有特異性結(jié)合的特點(diǎn)，具有特異性的抗體與血細(xì)胞膜上抗原決定部位結(jié)合而反映出血細(xì)胞的不同類別及其免疫功能[7]。
　　1.5 密度梯度離心技術(shù)
　　密度梯度離心一般是純化病毒的一種常用方法[8-9]。原理是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度介質(zhì)的某些特定位置中而形成不同區(qū)帶的分離方法[10]。優(yōu)點(diǎn)是分離出來(lái)的細(xì)胞或病毒仍有很好的活性，廣泛用于組織病理學(xué)研究中，近幾年在貝類血細(xì)胞的分類和功能領(lǐng)域得到應(yīng)用。以往主要采用氯化銫、蔗糖和多聚蔗糖作為梯度介質(zhì)進(jìn)行離心，但由于這幾種介質(zhì)的黏度高時(shí)滲透壓也會(huì)處于較高水平，會(huì)對(duì)部分分離的目標(biāo)病毒或細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此這種介質(zhì)純化出來(lái)的病毒或細(xì)胞需要進(jìn)行透析或稀釋才能應(yīng)用于后續(xù)研究。張輝等[10]人使用高親水性、高密度、低黏度的碘克沙醇作為介質(zhì)進(jìn)行梯度離心取得良好效果。
　　2 貝類血細(xì)胞分類
　　不同學(xué)者使用的研究技術(shù)手段以及研究對(duì)象不同，導(dǎo)致對(duì)貝類血細(xì)胞的分類命名存在一定差異（見(jiàn)表1）。
　　顯微鏡觀察法主要是根據(jù)血細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行分類，如陳全震等[11]通過(guò)透射電鏡觀察皺紋盤(pán)鮑（Haliotis discus hannai）血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，將其分為5種類型，分別為：大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、特殊顆粒細(xì)胞、透明細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞。并根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)和細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)特征判斷，大、小顆粒細(xì)胞是同一類細(xì)胞的不同發(fā)育階段，是由特殊顆粒細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的。透明細(xì)胞和淋巴細(xì)胞則是兩類分化完全的細(xì)胞；Nakayama等[12]使用光鏡和電鏡將紅番硨磲（Tridacna crocea）的血細(xì)胞分為3類，分別為：細(xì)胞內(nèi)含有直徑大約0.6μm顆粒的嗜酸性粒細(xì)胞，包含有低電子密度和少量高電子密度顆粒并擁有光滑表面的無(wú)顆粒細(xì)胞，以及細(xì)胞內(nèi)填充大量直徑約3μm高電子密度顆粒的類桑葚型細(xì)胞；Sahaphong 等[13]應(yīng)用光鏡和電鏡觀察耳鮑（Haliotis asinine）血細(xì)胞后認(rèn)為可分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞兩類；王江勇等[14]根據(jù)細(xì)胞大小、顆粒組成特征等將雜色鮑（Haliotis diversicolor）血細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞和無(wú)顆粒細(xì)胞。

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