長白山道地藥材接骨木、苦碟子纖溶酶分離及活性檢測

　　摘要：從具有活血化瘀功能的長白山道地藥材接骨木、苦碟子中分離纖溶酶，并利用纖維平板法對分離的纖溶酶進(jìn)行活性鑒定。結(jié)果表明：從接骨木和苦碟子中可以分離到具有溶栓活性的纖溶酶，其含量分別為1842μg/g及1976μg/g。尿激酶法測定其比活力分別為0.795U及0.837U，SDS-PAGE電泳檢測其大小約為36ku，該酶在高溫下失活，在70%～90%硫酸銨飽和溶液中活性最高。
　　關(guān)鍵詞：接骨木；苦碟子；纖溶酶；分離；活性檢測
　　中圖分類號(hào)：S567.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0315-02
　　心腦血管疾病是危害人類健康的主要疾病之一。近30年來，我國人群心血管疾病的發(fā)病率及危險(xiǎn)因素水平呈不斷上升趨勢。據(jù)衛(wèi)生部心血管病防治中心發(fā)布的《中國心血管疾病調(diào)查報(bào)告2011》：目前，我國包括冠心病、腦中風(fēng)、心力衰竭和高血壓在內(nèi)的心血管病病人估計(jì)已達(dá)2.3億[1-2]。因此研發(fā)高效、特異、安全、副作用小的溶栓藥物，一直是近年來醫(yī)藥界的熱門課題[3]。隨著對中醫(yī)藥認(rèn)識(shí)的發(fā)展，溶栓中草藥的研究也在不斷發(fā)展，已有部分中藥被制成了單味注射液，如刺五加、川芍、丹參、燈盞花、葛根素、紅花等[4]；同時(shí)，一些學(xué)者也在不斷研究新的溶栓藥用植物。接骨木、苦碟子作為長白山道地藥材，具有祛風(fēng)、活血，治風(fēng)濕筋骨疼痛，抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松及免疫活性等藥理作用[5-6]，但有關(guān)其在溶栓方面的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。因此本研究以長白山道地藥材接骨木、苦碟子為試驗(yàn)材料，采用硫酸銨沉淀，透析除去小分子物質(zhì)，用纖維平板法初步判斷接骨木、苦碟子粗提物中的溶纖成分，并對其活性做初步研究，為進(jìn)一步開發(fā)具有溶栓功能的長白山道地藥材提供理論依據(jù)。
　　1材料與方法
　　1.1試驗(yàn)材料
　　1.1.1中草藥接骨木、苦碟子采自通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)基地，經(jīng)生命科學(xué)學(xué)院秦佳梅教授鑒定。
　　1.1.2主要試劑纖維蛋白原、纖維蛋白溶酶原、凝血酶購自中國藥品生物制品檢定所，標(biāo)準(zhǔn)尿激酶、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶購自天津生物化學(xué)制藥廠。
　　1.2試驗(yàn)方法
　　1.2.1接骨木、苦碟子蛋白質(zhì)的提取
　　稱取接骨木、苦碟子干粉2g，浸于200mLPBS緩沖液中，4℃保存過夜，間隔時(shí)間振蕩，離心（4℃，4000r/min）10min，取上清，加入80%飽和硫酸銨溶液，離心（4℃，8000r/min）10min，沉淀用PBS溶解，得到蛋白粗提液，裝入透析袋用PBS緩沖液透析，每隔2h換1次溶液，取透析后的蛋白溶液冷凍干燥，-80℃冰箱中保存，備用。
　　1.2.2樣品蛋白提取物濃度的測定
　　采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）法[7]測定蛋白質(zhì)含量：取待測粗酶蛋白樣品溶液0.1mL，加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)溶液，測定595nm處吸光度，計(jì)算供試樣品的蛋白濃度。
　　1.2.3蛋白提取物的體外纖溶活性鑒定
　　纖維平板的配制及尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參照夏廣清等的方法[8]。
　　1.2.3.1判斷纖溶成分是否為蛋白質(zhì)
　　將供試品在沸水浴中加熱10min，點(diǎn)纖維蛋白板，若活性喪失，可初步判斷起溶纖作用的物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
　　1.2.3.2樣品蛋白溶液酶活力測定
　　分別取10μL接骨木、苦碟子蛋白質(zhì)提取液，加入纖維平板中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，觀察，如點(diǎn)樣孔周圍出現(xiàn)透明的溶圈，則證明被加樣品有溶栓效果，測量溶圈直徑，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到樣品溶液相對尿激酶活力。
　　1.2.3.3蛋白提取物的溶纖比活力測定
　　蛋白比活力（U/mg）=相對尿激酶活力（U）/[蛋白濃度（mg/mL）×點(diǎn)樣體積（mL）]。
　　1.2.4接骨木、苦碟子纖溶酶的SDS-PAGE檢測
　　按汪家政等的方法[9]，對蛋白質(zhì)進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)G-250染色。
　　2結(jié)果與分析
　　2.1接骨木、苦碟子粗酶提取液蛋白質(zhì)含量的測定
　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的吸光度，繪制蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算公式為：y=0.0074x-0.0102。依據(jù)公式通過吸光度測得接骨木、苦碟子粗酶蛋白含量分別為1842μg/g及1976μg/g。
　　2.2接骨木、苦碟子粗酶提取物蛋白成分鑒定及溶纖活力、比活力
　　根據(jù)尿激酶溶圈直徑的平方繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖
　　2），由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到酶活力計(jì)算公式為y=0.0102x+0.032。根據(jù)公式，由樣品蛋白在纖維平板上的溶圈直徑計(jì)算出接骨木及苦碟子粗提物蛋白比活力為分別0.795U及0.837U。
　　2.3接骨木、苦碟子粗酶提取物硫酸銨分級(jí)沉淀及體外溶栓試驗(yàn)
　　由圖3-A可見，從接骨木、苦碟子中可以分離出具有溶纖活性的纖溶蛋白。硫酸銨沉淀試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨飽和度在0～40%時(shí)，沉淀物無纖溶活性；當(dāng)硫酸銨飽和度在50%～60%時(shí)，沉淀物活性較低；而當(dāng)硫酸銨飽和度為70%～90%，沉淀物活性最高（圖3-B），因此，后續(xù)試驗(yàn)均采取70%～90%飽和硫酸銨沉淀。
　　2.4接骨木、苦碟子粗酶提取物蛋白成分鑒定
　　將提取到的接骨木、苦碟子粗酶提取物在沸水中煮沸5min，將煮沸后的樣品進(jìn)行溶纖試驗(yàn)，纖維平板上未見任何溶解現(xiàn)象，表明接骨木、苦碟子中具有溶栓作用的為蛋白質(zhì)。
　　2.5接骨木、苦碟子纖溶酶的SDS-PAGE檢測
　　對得到的接骨木、苦碟子粗酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，從這2種長白山道地藥材中可分離到分子量為15～45ku的蛋白質(zhì)（圖4），經(jīng)離子交換層析后，得到分子量大約為36ku的明顯條帶（圖5），因此，初步判斷接骨木、苦碟子纖溶蛋白酶的分子量大約為36ku。

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