RP—HPLC測定茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的含量

　　摘要：建立了測定茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的反相高效液相色譜分析方法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）。樣品經(jīng)超聲提取后，利用Kromasil C18色譜柱分離，流動相為乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL），流速0.8 mL/min，檢測波長278 nm，柱溫30 ℃。沒食子酸進樣量在0.066～1.650 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 9），平均回收率為97.1%，RSD為1.1%（n=6）；兒茶素進樣量在0.240～6.000 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 6），平均回收率為 97.5%，RSD為1.5%（n=6）；表兒茶素進樣量在0.252～6.300 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 7），平均回收率為 96.9%，RSD為12%（n=6）。試驗結(jié)果表明，建立的方法操作簡便、數(shù)據(jù)精確，可用于茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的含量測定。
　　關鍵詞：茶葉；沒食子酸；兒茶素；表兒茶素；RP-HPLC
　　中圖分類號： TS272.7 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0322-02
　　收稿日期：2013-10-28
　　作者簡介：鄒盛勤（1970—），男，江西奉新人，碩士，教授，從事天然產(chǎn)物活性成分的提取與分析研究。E-mail：zsqycxy@163.com。
　　通信作者：姜瓊，男，湖北潛江人，碩士，講師，從事天然產(chǎn)物開發(fā)與研究。E-mail：qqj2000@163.com。茶葉為山茶科山茶屬植物茶（Camellia sinensis）的芽葉。茶葉一名始載于《名醫(yī)別錄》，“世醫(yī)治暑病，以茶葉飲為首藥”[1]。茶葉全草可作藥用，性微溫，具有發(fā)汗解暑、行水散濕、溫胃調(diào)中、利水消腫的功效[2]。我國擁有豐富的茶葉資源和數(shù)千年的茶文化歷史。茶葉中具有多種活性成分，如茶多酚、茶多糖、茶皂素、可可堿、咖啡堿、揮發(fā)油、氨基酸等，其中多酚類化合物主要由沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等30多種化學物質(zhì)組成[3]，具有調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、抗衰老、美容減肥等藥理作用[3-5]。茶多酚的定量方法主要有高效液相色譜法和毛細管電泳法等[6-9]。茶葉化學成分的研究報道較多，但同時測定茶葉樣品中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素含量的方法尚未見報道。本試驗建立反相高效液相色譜法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）同時測定浙產(chǎn)茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的含量，旨在為茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的定量分析及其藥效基礎物質(zhì)的研究提供依據(jù)。
　　1材料與方法
　　1.1材料與儀器
　　沒食子酸、表兒茶素和兒茶素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為：110831-200302、110877-200916、110831-200911），乙腈（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。084龍井、龍井、白茶、越劍茶和浙農(nóng)113茶葉品種均購自浙江省，經(jīng)鑒定為茶（C. sinensis）的芽葉。
　　Waters高效液相色譜儀（515泵，2996光電二極管陣列檢測器，Empower中文色譜工作站，美國）；RO-MB-10D高純水機（杭州永潔達膜分離設備廠）；CP225D電子分析天平（德國Sartourius公司）；FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK2510HP超聲波清洗器（上�？茖С�聲儀器有限公司，功率：250W，頻率：59 kHz）。
　　1.2溶液配制
　　1.2.1對照品溶液分別精確稱取1.32、4.80、5.04 mg沒食子酸、兒茶素和表兒茶素對照品，置于20 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解后，稀釋至刻度，搖勻后配制成含0.066 mg/mL沒食子酸、0.240 mg/mL兒茶素和0.252 mg/mL表兒茶素的對照品混合溶液。
　　1.2.2 樣品溶液茶葉樣品于恒溫干燥箱中80 ℃下干燥 6 h，高速粉碎機粉碎。分別精確稱取2 g各茶葉樣品粉末，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入50 mL 95%乙醇后稱重；超聲提取45 min，冷卻后用甲醇補足損失重量，搖勻后用 0.45 μm 濾膜過濾，取過濾液作為樣品溶液。
　　1.3檢測波長的選擇
　　對照品溶液采用光電二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，選擇合適的檢測波長。
　　1.4色譜條件
　　色譜柱為Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL）；流速 0.8 mL/min；檢測波長278 nm；柱溫為30 ℃。
　　1.5精密度試驗
　　分別精確吸取10 μL含沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的對照品混合溶液，平行進樣5次，以峰面積計算色譜系統(tǒng)精密度。
　　1.6重現(xiàn)性試驗
　　取5份茶葉樣品，每份約2 g，按“1.2.2項”中樣品溶液制備方法制備樣品溶液。精確吸取樣品溶液各10 μL，分別進樣，測定其峰面積積分值，用外標法計算含量。
　　1.7加樣回收率試驗
　　精確稱取6份已知沒食子酸、兒茶素、表兒茶素含量的茶葉樣品，每份約1 g，按高、中、低3種濃度分別加入適量對照品制備樣品溶液，進樣測定含量。
　　1.8線性關系試驗
　　用微量注射器精確吸取1、7、13、20、25 μL含沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的對照品混合貯備液，進樣分析，按色譜條件測定峰面積，以對照品的進樣量為橫坐標（μg），峰面積為縱坐標（μV·s）。
　　1.9樣品含量測定
　　精確吸取制備的樣品溶液各10 μL，平行進樣3次，測定沒食子酸、兒茶素和表兒茶素峰面積積分值，外標法計算平均含量。
　　2結(jié)果與分析
　　2.1檢測波長
　　試驗測得對照品溶液中沒食子酸最大吸收波長為2163、271.7 nm，兒茶素最大吸收波長為203.4、278.8 nm，表兒茶素最大吸收波長為203.4、278.8 nm（圖1）。因此選擇278.0 nm作為檢測波長，此波長下沒食子酸、兒茶素和表兒茶素均有較強的紫外吸收，信噪比高，基線平穩(wěn)。
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