基于響應(yīng)面分析法對(duì)煙葉中果膠測(cè)定方法的優(yōu)化

　　摘 要：為了對(duì)酶解-連續(xù)流動(dòng)法測(cè)定煙葉中果膠含量的方法進(jìn)行優(yōu)化，采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法對(duì)酶解過程中的酶解溫度、酶解時(shí)間和緩沖液pH值進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，酶解溫度對(duì)果膠測(cè)定影響最大，緩沖液pH次之，酶解時(shí)間影響最小，且最優(yōu)酶解條件為酶解時(shí)間1.9 h、酶解溫度56 ℃、緩沖液pH 3.8；在此條件下，果膠具有良好的線性關(guān)系（R2=0.999），加標(biāo)回收率在99.2%～100.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6）<3%；說明Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化所得的果膠測(cè)定方法具有較好的精密度及準(zhǔn)確度，適用于煙葉中果膠含量的批量測(cè)定。
　　關(guān)鍵詞：響應(yīng)面分析；連續(xù)流動(dòng)法；煙葉果膠；定量測(cè)定
　　中圖分類號(hào)：TS411 文章編號(hào)：1007-5119（2015）05-0085-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.05.016
　　Abstract： In order to optimize the method of determining tobacco pectin using enzymolysis-flow method， reaction temperature， enzymatic hydrolysis time and buffer pH were studied through the Box-Benhnken experimental design and response surface methodology. The results showed that reaction temperature had the greatest impact on the determination of pectin， followed by buffer pH， and the enzymatic hydrolysis time comes last. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were pH 3.8， time 1.9 h and 56 ℃. Under this condition， the linear relationship of pectin was optimal （R2=0.999）， with the recovery of pectin in tobacco ranged from 99.2% to 100.9%， and the RSD （n=6） was less than 3%. This suggested that the optimized enzymatic hydrolysis conditions used by the Box-behnken design and response surface analysis have good precision and accuracy and are suitable for testing large number of samples.
　　Keywords： response surface methodology； continuous flow method； tobacco pectin； quantitative determination
　　果膠是煙葉細(xì)胞壁中膠層的主要組分，其含量集中在5%～9%[1]，其結(jié)構(gòu)主要是半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸[2]。研究表明，果膠對(duì)煙葉保濕能力和柔韌性有著重要的作用[3]；但是，過高的果膠含量在煙草吸食過程中分解產(chǎn)生的甲醇對(duì)卷煙安全性具有不利影響[4]。因此，準(zhǔn)確測(cè)定煙葉中的果膠含量對(duì)于評(píng)價(jià)煙草品質(zhì)有著重要的意義[5]。
　　目前，果膠測(cè)定方法主要有兩大類：一類是直接測(cè)定果膠酸含量，果膠含量以果膠酸計(jì)，如重量法、容量法為主[2]，該類方法操作復(fù)雜且重復(fù)性差，目前已較少采用；另一類是通過酸解或者酶解將果膠水解，采用現(xiàn)代分析儀器測(cè)定水解產(chǎn)物半乳糖醛酸含量，并以半乳糖醛酸來(lái)計(jì)果膠含量，如咔唑比色法[2]、色譜法[6-12]和酶解-連續(xù)流動(dòng)法[13-15]等。其中，比色法基質(zhì)干擾較大而造成測(cè)定結(jié)果偏高[7-9]，色譜法雖然具有較好的靈敏度及選擇性，但是該方法由于儀器操作復(fù)雜、檢測(cè)成本高等特點(diǎn)而難以推廣應(yīng)用。近年來(lái)，酶解-連續(xù)流動(dòng)法是一種備受關(guān)注的測(cè)定煙草中果膠含量的新方法，該方法條件溫和、解聚率高且重現(xiàn)性好[16]。然而，果膠酶酶解過程中的酶解溫度、酶解時(shí)間及緩沖液pH是影響準(zhǔn)確測(cè)定果膠含量的重要因素。為了更為客觀地反映上述三因素對(duì)酶解過程的影響及其交互效應(yīng)，文中采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了果膠酶對(duì)煙葉中果膠的酶解條件，為采用酶解-連續(xù)流動(dòng)法準(zhǔn)確測(cè)定煙草中果膠含量提供參考。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料和儀器
　　冰乙酸、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈣（AR，四川西隴化工有限公司）；對(duì)羥基苯甲酸酰肼（純度：98%，ACROS公司）；半乳糖醛酸（純度≥97.0%，F(xiàn)Luka公司）；果膠酶（酶活力：30000 U/g，阿拉�。�；果膠（含量≥74.0%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；檸檬酸和檸檬酸三鈉（AR，上海國(guó)藥集團(tuán)）；0.45 μm水系微孔濾膜（Φ13 mm×0.45 μm，津騰）；濾紙（Φ12.5 cm，杭州特種紙業(yè)有限公司）；煙葉樣品。
　　AA3流動(dòng)分析儀（德國(guó)布朗盧比公司），SHB-III循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司SHZ-D），MS204S電子天平（d=0.1 mg，瑞士梅特勒公司），電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-6北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），水浴恒溫振蕩器（SHA-B金壇市金南儀器廠）和Milli-超純水系統(tǒng)。
　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

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