HPLC法同時測定不同產(chǎn)地甘草藥材中甘草酸和甘草苷的含量

　　【摘要】目的：測定不同產(chǎn)地甘草藥材中甘草酸和甘草苷的含量。方法：采用HPLC法，檢測波長為237 nm，流動相為0.05%磷酸溶液-乙腈。結(jié)果：甘草苷和甘草酸的線性范圍分別為0.050~ 0.375 μg和0.40~3.00 μg，平均回收率分別為100.15%和98.76%。結(jié)論：所建HPLC方法操作簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為不同產(chǎn)地甘草藥材的質(zhì)量評價提供依據(jù)。
　　【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；甘草；甘草酸；甘草苷；含量測定
　　Determination of glycyrrhizic acid and liquiritin in
　　Glycyrrhizae radix et rhizoma by HPLC
　　Li Ru-Jie
　　(Pharmacy of Sichuan Orthopaedic Hospital, Chengdu 610041, China)
　　【Abstract】Objective: To establish an HPLC method for determining the contents of glycyrrhizic acid and liquiritin in Glycyrrhizae radix et rhizoma. Methods: The mobile phase was acetonitrile and water containing 0.05% phosphoric acid. The detection wavelength was set at 237nm. Results: The linear range of glycyrrhizic acid and liquiritin was 0.40~3.00 μg, 0.050~ 0.375 μg and the average recovery was 98.76%, 100.15%, respectively. Conclusion: The developed method is simple, accurate, and can provide a scientific basis for the quality evaluation of Glycyrrhizae radix et rhizoma.
　　【Key words】HPLC; Glycyrrhizae radix et rhizoma; Glycyrrhizic acid; Liquiritin; Content determination
　　【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】2095-6851（2014）06甘草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。《中國藥典》2010年版規(guī)定甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖［1］。甘草味甘、平，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、調(diào)和諸藥的功效，臨床上多用于治療脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸氣短、四肢攣急疼痛等癥［1］。
　　甘草主要含三萜皂苷和黃酮類成分，如甘草酸、甘草苷、甘草素等［2-3］。現(xiàn)代研究表明，甘草酸和甘草苷是甘草中主要的生物活性物質(zhì)，甘草酸具有抗炎、保肝、抗腫瘤等作用［4］，甘草苷能抗抑郁、保護神經(jīng)細(xì)胞，并對肝臟毒性有明顯的保護作用［5］。本文采用HPLC法測定了不同產(chǎn)地甘草藥材中甘草酸和甘草苷的含量，為甘草藥材的質(zhì)量評價提供了參考依據(jù)。
　　1儀器與試藥
　　美國Agilent 1260高效液相色譜儀；CQ-250超聲波清洗器（上海必能信有限公司）；Sartorius BP121s電子天平 (北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。乙腈為色譜純（Fisher），水為超純水，乙醇、磷酸等試劑均為分析純。甘草苷對照品（批號：111610-200604）和甘草酸銨對照品（批號：0731-9704）均購自中國藥品生物制品檢定所。本文共收集了10批甘草藥材，主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古、新疆、甘肅和寧夏等地。
　　2方法與結(jié)果
　　2.1 色譜條件
　　Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm, 5 μm)；檢測波長：237nm；柱溫：30 ?C；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A相為0.05％磷酸溶液，B相為乙腈，進行梯度洗脫，洗脫程序為：0~8 min, 19%~19% B；8~35 min, 19%~50% B；35~36 min, 50%~100% B；36~40 min, 100%~19% B。
　　2.2 對照品溶液的制備
　　取甘草苷對照品、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1ml含甘草苷25μg、甘草酸銨0.2mg的混合對照品溶液，即得（甘草酸重量 = 甘草酸銨重量/1.0207）。
　　2.3 供試品溶液的制備
　　取本品粉末約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
　　2.4 線性關(guān)系考察
　　取甘草苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1ml含甘草苷25μg、甘草酸銨0.2mg的混合對照品溶液。再分別精密吸取2、3、5、8、10、15μL混合對照品溶液，注入液相色譜儀，測定峰面積。以對照品進樣量(μg)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果甘草苷的回歸方程為Y = 2426.7 X - 0.1355（r = 0.9999），線性范圍為0.050~ 0.375 μg；甘草酸的回歸方程為Y = 443.54 X - 1.3603（r = 0.9999），線性范圍為0.40~3.00 μg。
　　2.5 方法學(xué)考察
　　2.5.1 精密度試驗
　　精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為1.18%、1.45%，表明儀器精密度良好。
　　2.5.2穩(wěn)定性試驗
　　取同一供試品溶液，于制備后0、1、2、4、8、12 h進行測定，記錄峰面積，計算2種成分的峰面積RSD。結(jié)果甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為1.58％、2.06％，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
　　2.5.3重復(fù)性試驗
　　取同一批樣品粉末約0.2 g，共6份，精密稱定，按上述供試品溶液制備方法分別制備供試品溶液。在上述色譜條件下，依法測定，計算甘草苷和甘草酸的含量。結(jié)果甘草苷和甘草酸含量的RSD分別為2.08%、2.26%，表明該方法重復(fù)性良好。
　　2.5.4加樣回收試驗
　　取同一批已知含量的甘草樣品粉末9份，每份約0.1 g，精密稱定，分別按已知含量的80%，100%，120%三個水平加入對照品，再按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定甘草苷和甘草酸的含量，計算回收率。結(jié)果甘草苷的平均回收率為100.15%，RSD為2.07%；甘草酸的平均回收率為98.76%，RSD為1.72%。
　　2.6 樣品含量測定
　　分別取不同產(chǎn)地的甘草藥材粉末約0.2g，精密稱定，按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，計算甘草苷和甘草酸的含量。對照品及甘草供試品溶液的HPLC色譜圖見圖1，含量測定結(jié)果見表1。
　　
　　圖1 對照品（A）和甘草供試品（B）的HPLC圖譜
　　表1不同產(chǎn)地甘草藥材中甘草苷和甘草酸的含量測定結(jié)果(n=3)
　　編號藥材
　　產(chǎn)地甘草苷
　　含量（%）甘草酸
　　含量（%）編號藥材
　　產(chǎn)地甘草苷
　　含量（%）甘草酸
　　含量（%）1內(nèi)蒙古
　　和林格爾1.244.126內(nèi)蒙古
　　依克昭盟1.143.982內(nèi)蒙古
　　鄂爾多斯1.093.517新疆吉
　　木薩爾0.853.863新疆
　　和靜0.984.068甘肅
　　慶城1.052.764甘肅
　　隴西0.752.989寧夏
　　鹽池0.823.385寧夏0.813.2410甘肅
　　酒泉0.683.05
　　3討論
　　在供試品溶液制備時，考察了乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇溶劑的提取效率，結(jié)果70%乙醇對兩個成分的提取效果最佳；考察了不同提取方法（超聲、冷浸和水浴回流），結(jié)果超聲比回流、冷浸提取的效率更高。此外，還對提取時間、提取次數(shù)、溶媒用量等參數(shù)進行了考察，最終確定了最佳的供試品溶液制備方法。 《中國藥典》2010年版“甘草”項下規(guī)定：按干燥品計算，甘草藥材含甘草苷不得少于0.50%，甘草酸不得少于2.0%。本文研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)于內(nèi)蒙古、新疆、甘肅和寧夏等地的10批藥材中甘草苷和甘草酸的含量均符合規(guī)定，表明收集的甘草藥材質(zhì)量均合格。其中，產(chǎn)于內(nèi)蒙古和林格爾縣的甘草藥材中的甘草苷（含量為1.53%）和甘草酸（含量為4.12%）含量最高，而來自于甘肅酒泉的甘草藥材中的甘草苷含量最低，為0.68%。
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