基于ITS2和?psbA—trnH?序列對(duì)細(xì)小種子類藥材車前子的鑒定比較

　　[摘要]為考察ITS2 序列和psbA-trnH 序列對(duì)車前子藥材及其常見(jiàn)混偽品的鑒定能力，該研究對(duì)車前子2個(gè)基原物種及7種混偽品共71份樣本進(jìn)行了研究。采用MEGA 5.1對(duì)獲得的ITS2和psbA-trnH進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算種內(nèi)和種間kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，車前和平車前的ITS2 序列長(zhǎng)度分別為199，200 bp；兩者的ITS2序列種內(nèi)最大 K2P 遺傳距離均小于與混偽品的最小種間K2P 遺傳距離；基于ITS2 序列構(gòu)建的NJ 樹(shù)中，車前、平車前及其混偽品都表現(xiàn)出良好單系性，都能相互明顯區(qū)分。表明ITS2序列能將車前子藥材與混偽品進(jìn)行很好的區(qū)分。車前和平車前的psbA-trnH序列長(zhǎng)度均為340 bp，兩者的psbA-trnH 序列種內(nèi)最大K2P 遺傳距離小于與混偽品的最小種間K2P 遺傳距離；基于psbA-trnH 序列構(gòu)建的NJ 樹(shù)結(jié)果顯示，除大車前外，車前子藥材與其余混偽品可以明顯區(qū)分。因此，ITS2序列作為DNA條形碼，車前子及其混偽品具有良好的鑒別能力，對(duì)保障車前子用藥安全具有重要意義。
　　[關(guān)鍵詞]車前子；混偽品；DNA 條形碼；ITS2 ；psbA-trnH
　　車前子為車前科植物車前Plantago asiatica L. 或平車前P. depressa Willd. 的干燥成熟種子，具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰等功效^[1]。車前子為常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并列為上品。目前，車前子的鑒別多從外觀性狀、顯微鑒別和理化等方面進(jìn)行研究^[2-4]。車前子常見(jiàn)的混偽品有大車前、長(zhǎng)葉車前、葶藶子、青葙子、菟絲子等^[4]。由于車前子及其混偽品都屬于極細(xì)種子類藥材，從外觀形態(tài)上很難將其進(jìn)行區(qū)分，傳統(tǒng)的鑒定方法已經(jīng)無(wú)法滿足目前的要求，急需一種快速準(zhǔn)確的鑒定方法，以確保臨床用藥安全。
　　DNA 條形碼技術(shù)是當(dāng)今生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)和方向。該技術(shù)簡(jiǎn)便高效，不受樣品的形態(tài)限制，能對(duì)中藥材進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定^[5-7]。國(guó)家藥典委員會(huì)于2012年討論并通過(guò)在《中國(guó)藥典》（2010年版）增補(bǔ)本中列入《中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》，該指導(dǎo)原則通過(guò)對(duì)大樣本量中藥材進(jìn)行DNA 條形碼分子鑒定研究，建立以ITS2序列為核心、psbA-trnH 序列為輔的植物類藥材DNA 條形碼鑒定體系^[8]。
　　本研究以車前子藥材及其常見(jiàn)混偽品作為研究對(duì)象，驗(yàn)證ITS2 序列以及psbA-trnH 序列作為DNA 條形碼對(duì)車前子藥材及其混偽品鑒定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，保障車前子用藥安全。
　　1 材料
　　本研究共收集71份樣本，其中車前子藥材共39份（車前32份，平車前7份），車前子基原植物樣本共9份（車前5份，平車前4份），混偽品7個(gè)物種共32份樣本，樣品來(lái)源見(jiàn)表1。樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。
　　2 方法
　　2.1 DNA提取 取藥材或硅膠干燥的葉片約40 mg，用高通量組織研磨儀（Sceintz-48，寧波新芝）研磨2 min （30次/min），使用植物基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA。
　　在提取過(guò)程中，樣品研磨后加入700 μL 核分離緩沖液抽提3次，加入細(xì)胞裂解液56 ℃水浴8～9 h。其余步驟按DNA 提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
　　2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 ITS2序列和psbA-trnH序列PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件參見(jiàn)《中藥DNA條形碼分子鑒定》^[9]，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)并純化后，使用ABI 3730XL （Applied Biosystems Co.，USA）測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。
　　2.3 數(shù)據(jù)處理 獲得的測(cè)序峰圖采用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.，USA）校對(duì)拼接，去除引物區(qū)及低質(zhì)量區(qū)。使用隱馬爾可夫模型HMMer序列注釋方法^[10]去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得ITS2 序列。通過(guò)與GenBank序列進(jìn)行Blastn比對(duì)，通過(guò)參考序列進(jìn)行注釋，獲得psbA-trnH 序列。用軟件MEGA 5.1進(jìn)行序列比對(duì)^[11]，基于Kimura-2-parameter （K2P）模型計(jì)算遺傳距離，并用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)，利用bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。
　　3 結(jié)果與分析
　　3.1 車前子藥材DNA提取及PCR擴(kuò)增效率 由于車前子中含大量黏液質(zhì)（多糖類化合物）^[12-14] ，按照常規(guī)方法提取車前子DNA，提取效率較低。本文在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)改進(jìn)DNA提取方法，可以成功提取所有樣品DNA，其PCR產(chǎn)物電泳后均可顯示出單一目的條帶，ITS2序列和psbA-trnH序列的擴(kuò)增效率均可達(dá)到100%。經(jīng)雙向測(cè)序后，能得到高質(zhì)量的ITS2序列和psbA-trnH序列。
　　3.2 車前子藥材及其混偽品ITS2序列特征 車前和平車前ITS2序列長(zhǎng)度分別為199，200 bp，G+C含量分別為54.7%，52.9%。來(lái)自于北京、重慶、浙江杭州等15個(gè)產(chǎn)地的36條車前ITS2序列種內(nèi)無(wú)任何變異位點(diǎn)，序列相似性100%；來(lái)自于北京、吉林長(zhǎng)白山、河北涿州等5個(gè)產(chǎn)地的12條平車前ITS2序列僅1個(gè)變異位點(diǎn)，可分為2個(gè)單倍型（表1），其中單倍型B1共10條序列，單倍型B2共2條序列，見(jiàn)表2。與平車前12條ITS2序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)36條車前序列在33 bp處有一個(gè)穩(wěn)定的堿基缺失。

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