貝母類藥材湖北貝母Fritillaria,hupehensis系統(tǒng)位置的探討——來自ITS，rpl16，mat,K序列的證據(jù)

　　[摘要]湖北貝母為傳統(tǒng)中藥，然而《Flora of China》將其基原植物湖北貝母Fritillaria hupehensis歸并于天目貝母F.monantha項下。該實驗采用分子系統(tǒng)學方法，以川百合Lilium davidii為外類群，用核基因ITS序列和葉綠體基因rpl16序列、matK序列等3個片段對湖北貝母及其近緣類群天目貝母F.monantha、安徽貝母F. anhuiensis等進行聯(lián)合建樹分析，對湖北貝母植物的系統(tǒng)位置進行了探討，為湖北貝母藥材的安全使用提供分子證據(jù)。結(jié)果顯示，分子系統(tǒng)樹上，3種貝母各自的居群聚為一支，之后天目貝母與安徽貝母聚為一支，最后與湖北貝母聚為一支。表明湖北貝母與天目貝母的親緣關(guān)系可能要遠于安徽貝母與天目貝母之間的關(guān)系，因此不適宜將湖北貝母歸并于天目貝母。
　　[關(guān)鍵詞]湖北貝母； 天目貝母； 安徽貝母； ITS； rpl16； matK
　　貝母為我國傳統(tǒng)中藥，具有清熱化痰，止咳散結(jié)的功效，2010年版《中國藥典》^[1]中記載了5個品種的貝母類藥材，分別是川貝母、浙貝母、湖北貝母、伊貝母和平貝母，涵蓋了貝母屬植物10種1變種。貝母屬植物主要分布于北半球的溫帶地區(qū)，全世界130多種，中國有20多種，除《中國藥典》記載的種類外，在中國民間，其余貝母屬物種也多作為貝母類藥材的代用品使用。然而，由于形態(tài)性狀變異復雜，加之可能存在的種間雜交^[2-3]，使得該屬，特別是東亞地區(qū)物種分類處理并不十分清晰，這直接導致了藥材使用上的不便，如藥材湖北貝母的基原植物湖北貝母Fritillaria hupehensis為《中國藥典》2010年版所收錄，中文版《中國植物志》^[4]也承認該種的成立，然而隨后《中國植物志》的同一作者卻出版了截然不同的意見，陳心啟等^[3]在討論長江中下游地區(qū)的貝母屬分類時，認為湖北貝母的性狀變異幅度在廣義的天目貝母F.monantha性狀變異范圍內(nèi)，進而在2000年出版的《Flora of China》中將湖北貝母作為天目貝母的異名處理。這一處理是建立在形態(tài)學基礎(chǔ)上的，是否合理應該得到更多其他領(lǐng)域的數(shù)據(jù)支持，有待進一步深入研究探討。
　　近十幾年來，隨著分子直接測序技術(shù)的普及，DNA序列片段已經(jīng)被廣泛運用于植物系統(tǒng)學的研究。ITS為核核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，具有較快的進化速率，適于用來解決一些較低分類階元的問題，應用最為廣泛。葉綠體基因為單拷貝基因，有利于系統(tǒng)樹的構(gòu)建。rpl16是cpDNA中進化速率最快的內(nèi)含子之一，一般用于較低分類階元或近緣類群間^[5]。matK是葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)中進化最快的基因之一，也是近年中分子系統(tǒng)發(fā)育研究中使用頻率最高葉綠體片段之一^[6]。在國外尤其是中東地區(qū)，有關(guān)貝母屬分子系統(tǒng)的研究較為深入，但國內(nèi)這方面的報道還很少見，本實驗根據(jù)國外貝母屬分子系統(tǒng)學研究基礎(chǔ)^[7]選擇ITS，rpl16，matK 3個序列片段，對中國貝母屬下的部分植物開展分子系統(tǒng)學研究，焦點集中于與天目貝母和湖北貝母親緣關(guān)系較近的幾個物種，以期利用分子證據(jù)解決分類系統(tǒng)難題，同時也為貝母類藥材基源的準確分類和應用提供更多的證據(jù)。
　　1 材料與方法
　　1.1 樣品采集 用于本實驗中湖北貝母、天目貝母及親緣關(guān)系較近的貝母屬植物均采自模式產(chǎn)地的野外或栽培居群，為硅膠干燥的新鮮葉片，可以較好的代表該種貝母植物，來源見表1。植物標本由北京藥用植物研究所張本剛研究員鑒定，憑證標本保存于北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所資源中心。另外伊貝母以及作為外類群分析用的川百合序列來源于GenBank。
　　1.4 PCR擴增與測序 PCR擴增反應在ABI 2720PCR擴增儀上進行。PCR酶采用北京艾德萊生物科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix。
　　PCR擴增反應體系25 μL：12.5 μL Master Mix，引物（ITS 2.5 μmol·L^-1；rpl16，matK 5 μmol·L^-1） 各1，2 μL總DNA樣品，8.5 μL ddH2O。
　　PCR擴增程序為：94 ℃預變性（ITS 3 min；rpl16，matK 5 min）；94 ℃變性1 min，退火1 min（ITS 58 ℃；rpl16 54 ℃；matK 53 ℃ ），72 ℃延伸（ITS，rpl16 2 min；matK 2.5 min）；循環(huán)數(shù)（ITS 32；rpl16，matK 35 ）；72 ℃延伸（ ITS 5 min；rpl16，matK 7 min）；4 ℃保存。
　　1.5 序列測定 PCR 產(chǎn)物的純化和序列測定均由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司完成。 PCR 產(chǎn)物直接雙向測序，測序引物為PCR引物。為保證測序順利，部分樣品的matK序列加測了中間引物。
　　1.6 序列分析 所測序列用CodonCode Aligner 3.7.1（Condon Code Co.，Germany）進行校對拼接，然后用MEGA5.2對其與從GenBank中下載的序列進行比對。以川百合為外類群，采用對最大簡約法（maximum parsimony， MP）、最大似然法（maximum likelihood， ML）對3個序列進行聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)樹：最大簡約樹的構(gòu)建采用PAUP4.0b10進行，使用啟發(fā)式搜索，TBR分支交換算法；最大似然樹的構(gòu)建采用MEGA5.2進行，使用T-3-P + G的模型。最大似然使用的模型由MEGA5.2計算所得。用靴帶分析（bootstrap）1 000次重復檢驗分支的可靠性，空缺（gap）始終做缺失（missing）處理。
　　2 結(jié)果與分析

相關(guān)熱詞搜索：貝母 湖北 序列 證據(jù) 探討