對照提取物用于當歸藥材質量控制的研究

　　[摘要]為提高當歸藥材的質量標準，解決部分對照品稀缺問題，進行了以對照提取物為對照的當歸藥材質量控制研究。采用色譜分離技術制備對照提取物，并對其中3個指標成分阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H進行標定，建立了以對照提取物為對照的當歸藥材UPLC含量測定方法，并采用t檢驗對以對照提取物和對照品為對照的測定結果進行比較，結果基本一致，該方法可用于當歸藥材質量控制，且經濟實用，本研究初步驗證了其可行性。
　　[關鍵詞]當歸；對照提取物；質量控制
　　中藥材中活性成分的含量是決定其質量優(yōu)劣、有效性和安全性的主要因素，因此成分的定量分析是中藥材質量控制的關鍵。同時中藥的復雜性決定了以單一成分為指標難以全面地評價其質量，多成分含量測定逐漸成為中藥質量控制的趨勢。然而這種質量評價模式，卻受到中藥化學對照品分離難度大、單體不穩(wěn)定或供應價格高等因素的制約^[1]，限制了其在中藥生產企業(yè)的推廣應用^[2]，導致中藥質量標準提高的步伐遲緩�！耙粶y多評”的含量測定方法在一定程度上解決了中藥對照品缺失、價格昂貴及不穩(wěn)定的問題，現(xiàn)已在丹參、黃連、金銀花等多種藥材的多成分定量分析和多指標質量控制中得到應用3-5，但此法在相對校正因子的定量、指標成分的色譜峰定性，尤其是方法的實用性和耐用性方面尚存在一些問題^[6]。開發(fā)中藥對照提取物可能成為有效措施之一^[7]，對照提取物為中藥的“標準”提取物，其組分比例相對固定，且指標性成分含量已經采用相應的對照品進行標定，可配制成不同濃度的系列標準溶液，用于中藥材多成分分析^[8]，尤其適用于組分明確但單體對照品不易獲得的成分測定。目前以對照提取物為對照的含量測定方法仍處于起步和探索階段，關于其用于中藥質量控制的適用性和可行性報道較少。
　　當歸是中醫(yī)臨床常用藥材，為傘形科植物當歸Angelica sinensis （Oliv.）Diels的干燥根。目前，關于當歸質量控制方法的研究很多，定性方面以薄層色譜鑒別和指紋圖譜研究為主，含量測定方面主要是以單成分阿魏酸為指標，阿魏酸普遍存在于多種中藥材中，專屬性較差，僅以其為指標不能全面地評價當歸藥材質量^[9-11]。同時當歸中的一些活性成分如藁本內酯、丁烯基苯酞等的穩(wěn)定性差，在實際應用中難以作為質控指標進行藥材的質量控制^[12-13]。本實驗制備對照提取物操作簡便且成本較低，可在兩類成分上控制當歸藥材質量，同時解決了洋川芎內酯I及洋川芎內酯H對照品缺乏、價格昂貴等問題，建立了以對照提取物為對照的當歸藥材多成分含量測定方法，為其更為全面、專屬性更好的質量控制提供了科學依據(jù)。
　　1 儀器與試藥
　　Reveleris X2全息快速純化色譜系統(tǒng)（GRACE公司）；ACQUITY UPLC系統(tǒng)（二元高壓泵，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器，Waters公司）；MF-MS105電子分析天平（METTLER TOLEDO公司）；EPED-E2-30TF超純水系統(tǒng)（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）；KH -300型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。
　　對照提取物自制；阿魏酸對照品（批號110773-201012，供含量測定用），購于中國食品藥品檢定研究院；洋川芎內酯I（批號130601，供含量測定用）、洋川芎內酯H（批號130816，供含量測定用），均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；當歸藥材信息見表1，經南京中醫(yī)藥大學段金廒教授鑒定，均為傘形科植物當歸A. sinensis的干燥根。
　　2 方法與結果
　　2.1 對照提取物的制備
　　甘肅岷縣當歸藥材，切片，8倍量70%乙醇浸泡0.5 h，回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，減壓回收溶劑濃縮成稠膏。將稠膏與硅膠1∶1均勻拌樣，于80 ℃真空干燥，以含樣硅膠與空白硅膠1∶12干法上樣，用Reveleris X2中壓制備系統(tǒng)快速去除藁本內酯等極性小的成分，收集阿魏酸（1）、洋川芎內酯H（2）、洋川芎內酯I（3）部位，洗脫條件見表2，制備色譜圖見圖1。將收集得到的阿魏酸、洋川芎內酯H、洋川芎內酯I部位回收溶劑，得淺黃色油狀物。用適量甲醇溶解，使阿魏酸的質量濃度2.5～3.0 g·L^-1，0.22 μm微孔濾膜濾過，將濾液封裝于安瓿瓶中，即得所需的對照提取物。
　　2.2 對照提取物的標定
　　2.2.1 對照品溶液配制 精密稱取阿魏酸對照品28.50 mg、洋川芎內酯I對照品10.70 mg、洋川芎內酯H對照品2.06 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得各單一對照品儲備液。分別精密吸取上述對照品儲備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇定容，配制成含阿魏酸114 mg·L^-1、洋川芎內酯I 42.8 mg·L^-1、洋川芎內酯H 8.24 mg·L^-1的混合對照品溶液，再用70%甲醇逐級稀釋成一系列濃度的混合對照品溶液（濃度分別為阿魏酸：114，57.0，28.5，14.2，7.12，3.56 mg·L^-1；洋川芎內酯I：42.8，21.4，10.7，5.35，2.68，1.34 mg·L^-1；洋川芎內酯H：8.24，4.12，2.06，1.03，0.515，0.258 mg·L^-1）。
　　2.2.2 供試品溶液配制 精密吸取自制對照提取物1 mL，置于100 mL量瓶中，加70%甲醇定容，即得。
　　2.2.3 色譜條件 利用混合對照品建立工作曲線，見表3，并進行方法學驗證，色譜條件如下：ACQUITY UPLCR BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相：甲醇（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫[ 0～3 min，A-B （15∶85～35∶65）；3～4 min，A-B （35∶65～37∶63）；4～5 min，A-B （37∶63～37∶63）；5～8 min，A-B（37∶63～45∶55）；8～9 min，A-B（45∶55 ～15∶85）]；流速0.3 mL·min^-1；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進樣量5 μL；以阿魏酸計理論塔板數(shù)不低于8萬。在該色譜條件下，3個成分與相鄰組分達到基線分離，分離度均大于1.5。3批對照提取物含量標定結果，見表4，混合對照品、對照提取物及藥材的UPLC圖，見圖2。

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