太子參藥材的快速分子鑒定

　　[摘要]為建立一種簡(jiǎn)便快捷的太子參分子鑒定方法，對(duì)太子參藥材及其混偽品的rDNA-ITS片段進(jìn)行比對(duì)分析，找出特異性片段，設(shè)計(jì)太子參鑒別引物，并優(yōu)選擴(kuò)增條件，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)100×SYBR Green I染色后紫外光下觀察。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液（包括DNA Taq聚合酶預(yù)混液5.5 μL，Tzs-2F，Tzs-2R各10 pmol，DNA模板20～80 ng，雙重滅菌蒸餾水加至25 μL）經(jīng)95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性5 s，56 ℃退火延伸15 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸30 s后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1 μL 100×SYBR Green I混勻后于紫外光下呈綠色熒光的為太子參，混偽品無(wú)綠色熒光出現(xiàn)。40 min內(nèi)即可完成DNA提取、擴(kuò)增等整個(gè)鑒定過(guò)程。該方法能特異性擴(kuò)增太子參DNA，紫外光下肉眼觀察即可鑒定藥材的真?zhèn)�，且操作�?jiǎn)捷、結(jié)果準(zhǔn)確、利于推廣，可為快速鑒定中藥材的真?zhèn)翁峁﹨⒖肌?br>　　[關(guān)鍵詞]太子參；分子鑒定；特異性PCR；SYBR Green I
　　太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostella riaheterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤(rùn)肺的功效，用于脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足、肺燥干咳等癥的治療^[1]。作為藥食兩用品種，太子參近年來(lái)得到了廣泛的開(kāi)發(fā)與利用。為牟取私利，市場(chǎng)上出現(xiàn)以淡竹葉Lophatherum gracile Brongn.、繁縷Stellaria media （L.） Cirillo、寶鐸草Disporum sessile D. Don、直立百部Stemona sessilifolia （Miq.） Miq.、闊葉山麥冬Liriope platyphylla F. T. Wang & Tang、矮小山麥冬L. minor （Maxim.） Makino等植物的根或塊根冒充太子參銷售^[2-5]。其外形與太子參較為相似，特別是加工粉碎后，藥材飲片特征消失、細(xì)胞差異不明顯、理化反應(yīng)繁鎖等等。針對(duì)這種傳統(tǒng)鑒定方法難以準(zhǔn)確判定的易混藥材，建立一種操作簡(jiǎn)捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的新型鑒定方法具有現(xiàn)實(shí)價(jià)值和實(shí)踐意義。
　　DNA分子鑒定方法是根據(jù)基因組序列進(jìn)行比較研究，在很大程度上彌補(bǔ)和克服了傳統(tǒng)鑒定的缺陷和難題。其中的特異性PCR是根據(jù)正品、偽品藥材特定區(qū)域的DNA序列，設(shè)計(jì)有高度特異性的正品鑒別引物，此引物能有效擴(kuò)增來(lái)自正品藥材DNA模板中的特定區(qū)域。鑒定樣品時(shí)，用鑒別引物對(duì)所提取樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)鑒別樣品真?zhèn)?sup>[6]。但電泳過(guò)程繁瑣、耗時(shí)，所用溴化乙錠（EB）試劑污染環(huán)境和危害人體健康^[7]。探討一種更安全、更靈敏的分子標(biāo)記檢測(cè)方法將有助于特異性PCR鑒定技術(shù)的推廣及大規(guī)模樣品的鑒定。
　　本文針對(duì)太子參及其常見(jiàn)混偽品（淡竹葉、繁縷、寶鐸草、禾葉山麥冬、闊葉山麥冬、矮小山麥冬、直立百部、蔓生百部、對(duì)葉百部）的物種DNA，采用特異性PCR鑒定技術(shù)對(duì)DNA進(jìn)行特異性片段擴(kuò)增，然后在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入DNA核酸熒光染料SYBR Green I，紫外光下觀察熒光反應(yīng)的有無(wú)，從而判斷太子參藥材的真?zhèn)�。這是一種不需要凝膠電泳操作，即可準(zhǔn)確鑒定太子參藥材的快速分子鑒定方法。
　　1 材料
　　實(shí)驗(yàn)材料太子參藥材購(gòu)于貴州施秉、安徽宣城、江蘇句容、福建柘榮、山東臨沂等地，共37份樣本，每份樣本500～1 000 g，按產(chǎn)地混合后四分法取100 g打粉。另收集到太子參偽品共41份，分別為寶鐸草、繁縷、直立百部、蔓生百部、對(duì)葉百部、闊葉山麥冬、禾葉山麥冬、矮小山麥冬、淡竹葉，均為塊根，每份樣本100～200 g，按產(chǎn)地混合后四分法取100 g打粉。實(shí)驗(yàn)材料樣本數(shù)及產(chǎn)地見(jiàn)表1。樣品經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥教研室江維克教授鑒定。
　　瓊脂糖（西班牙Biowestagarose）；D2 000，10 000× SYBR Green I核酸染料（北京索萊寶科技有限公司）；2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；EB，2×Taq PCR MasterMix（北京天根生化科技有限公司）；Premix Ex TaqTM Version 2.0（寶生物工程大連有限公司）；其他試劑均為分析純。
　　PCR儀（Mastercycler，德國(guó)Eppendof）；核酸定量分析儀（NANODROP 2000，美國(guó)Thermo）；凝膠成像系統(tǒng)（GGM/D2，英國(guó)SYNGENE）；電腦三恒多用電泳儀（DYY-12，北京六一儀器廠）；自動(dòng)蒸汽滅菌鍋（ES-315，日本Tomy）；低溫高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5810R，德國(guó)Eppendof）；三用紫外儀（ZF-2，上海市安亭電子儀器廠）。
　　2 方法
　　2.1 基因組DNA的提取及檢測(cè) 采用堿裂解法提取各藥材樣品基因組DNA^[8-9]，核酸定量分析儀檢測(cè)DNA的濃度及純度。用通用引物ITS2F/ITS3R^[10]擴(kuò)增樣品DNA以驗(yàn)證模板DNA的質(zhì)量。引物序列及PCR擴(kuò)增方法見(jiàn)表2。DNA樣品保存于-20 ℃冰箱。
　　2.2 PCR引物設(shè)計(jì)與特異性篩選 在NCBI（National Center for Biotechnology Information，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）下載到太子參及其偽品物種的rDNA-ITS序列，ClustalX2.1軟件進(jìn)行排序、比對(duì)、分析，找出具有穩(wěn)定差異的特異性片段。運(yùn)用Premier Primer 5.0軟件針對(duì)太子參的特異性片段設(shè)計(jì)了3對(duì)鑒別引物，分別命名為Tzs-1F/Tzs-1R，Tzs-2F/Tzs-2R，Tzs-3F/Tzs-3R，序列見(jiàn)表2。各引物由上海生工生物科技有限公司合成。

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