UPLC法測定馬甲子藥材中馬甲子素和messagenic,acid,B

　　摘 要：建立UPLC同時測定馬甲子藥材中馬甲子素和messagenic acid B 2種抗腫瘤活性成分的方法。采用Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱，乙腈-0.1%甲酸溶液流動相梯度洗脫；流量：0.45 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長320 nm。結(jié)果表明：馬甲子素和messagenic acid B分別在0.198 6～3.972 μg，0.151 4～3.028 μg范圍進樣量與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，平均加標回收率分別為99.20%（RSD=1.34%）和99.69%（RSD=0.56%）。該方法能在3.5 min內(nèi)使馬甲子素和messagenic acid B最大程度地分離，相比較HPLC而言，更加快捷、高效。
　　關鍵詞： 馬甲子；messagenic acid B；超高效液相色譜；抗腫瘤活性
　　文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2017）04-0048-04
　　0 引 言
　　馬甲子（Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir）為鼠李科馬甲子屬植物，主要含有三萜類、總黃酮和環(huán)肽生物堿等成分，具有治療瘡癰潰瘍，解毒消腫的功效[1]。本課題組經(jīng)前期實驗研究，從馬甲子葉中分離出一種新型的五環(huán)三萜類化合物，結(jié)構鑒定并命名為馬甲子素。體外細胞實驗顯示，相比于馬甲子葉中抗腫瘤活性成分白樺脂酸[2-3]，馬甲子素的抗腫瘤活性更強[4]。單獨的馬甲子素含量的HPLC測定方法已見報道[5-6]。通過對馬甲子化學成分的進一步研究，從馬甲子葉中首次分離出一種化合物單體，經(jīng)鑒定為已知化合物messagenic acid B[7-8]，與馬甲子素僅存在單雙取代基的差異，均屬于以白樺脂酸為母核的五環(huán)三萜類衍生物，體外細胞實驗也表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性[9]。本文通過建立超高效液相色譜（UPLC）含量測定方法[10]，在10 min內(nèi)完成一次馬甲子樣品分析。此方法分離度好，重復性高，能同時測定馬甲子藥材中兩種活性成分，可較為全面地控制有效成分的含量，為馬甲子藥材的質(zhì)量控制和合理種植、采收提供科學依據(jù)。
　　1 實驗部分
　　1.1 儀器和試藥
　　Waters ACQUITY超高效液相色譜，包括四元高壓梯度泵、自動進樣恒溫樣品管理器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站。
　　乙腈（色譜純，美國Sigma）；超純水；甲酸、甲醇均為分析純（成都艾科達化學試劑有限公司）。
　　馬甲子素對照品和messagenic acid B對照品（成都普思生物科技股份有限公司，經(jīng)峰面積歸一法計算，純度均大于98%）；馬甲子鮮葉采于四川省成都市新津牧馬山，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學院鑒定為鼠李科馬甲子屬多年生木本植物馬甲子Paliurus ramosissmus（Lour.）Poir。
　　1.2 方法與結(jié)果
　　1.2.1 樣品的配置
　　分別精密稱取馬甲子素和messagenic acid B對照品1.986 mg、1.514 mg，用甲醇超聲溶解并定容至10 mL，即得各自對照品溶液。精密吸取各自對照品溶液2.5 mL至10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，混合均勻，作混合對照品溶液。
　　精密稱取經(jīng)冷凍干燥后的馬甲子葉粉末5.0 g（過4號篩），置具塞三角瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，80 ℃加熱回流提取3 h，取出冷卻后，補足減失質(zhì)量，搖勻過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
　　1.2.2 色譜條件
　　色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相A：乙腈；流動相B：0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序如表1所示，流量：0.45 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：320 nm；進樣量：4 μL；混合對照品和馬甲子供試品的色譜圖分別見圖1（a）和圖1（b）。
　　1.2.3 線性關系
　　分別精密吸取馬甲子素和messagenic acid B對照品溶液，按1，2，4，8，15，20 μL的進樣量，以1.2.2色譜條件進行檢測。以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線（見圖2），分別計算線性回歸方程：y（馬甲子素）=8×106x+36 725（r2=0.999 8）；y（messagenic acid B）=9×106x+51 485（r2=0.999 9）。表明馬甲子素對照品和messagenic acid B對照品分別在0.198 6～3.972 μg，0.151 4～3.028 μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。
　　1.2.4 精密度試驗
　　精密吸取混合對照品溶液4 μL，連續(xù)進樣5次，測定馬甲子素和messagenic acid B峰面積的RSD分別為1.48%和1.35%，表明儀器精密度較好，具體數(shù)據(jù)如表2所示。
　　1.2.5 重復性試驗
　　精密稱取同一批次的馬甲子葉粉末5份（過4號篩），按1.2.1方法制得供試品溶液，進樣4 μL，測定馬甲子素和messagenic acid B的含量，其RSD分別為1.93%和0.93%，表明本方法具有較好的重復性，具體數(shù)據(jù)如表3所示。
　　1.2.6 穩(wěn)定性試驗
　　精密稱取等量同一批次的馬甲子葉粉末（過4號篩），按1.2.1方法制得供試品溶液，分別在2，4，8，
　　10，12，24 h進樣4 μL，測定馬甲子素和messagenic acid B的含量，其RSD分別為0.87%和1.20%（如表4所示）。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
　　1.2.7 加標回收率試驗

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