茶葉生產(chǎn)廢料中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的純化工藝

　　摘要：分析了茶葉生產(chǎn)廢料中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的純化工藝，并采用大孔樹脂對其進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明，運(yùn)用靜態(tài)吸附與動(dòng)態(tài)吸附相結(jié)合的方法分析得到，適用于茶葉生產(chǎn)廢料中EGCG分離純化用的大孔吸附樹脂為D101。其最佳分離純化條件為：將20.0 mg/mL上柱液以1.5 BV/h上柱4.5 BV，使用20%乙醇以0.5 BV/h洗脫4.0 BV。
　　關(guān)鍵詞：茶葉生產(chǎn)廢料；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）；純化
　　中圖分類號(hào)：S571.1；TS272.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）18-4570-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.045
　　茶葉是恩施土家族苗族自治州的六大經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一，在其生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢料——茶梗、茶末、茶樹修剪枝條等。這些廢料因含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯（以下簡稱EGCG）而極具開發(fā)價(jià)值[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，EGCG具有抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、對糖尿病腎臟的保護(hù)、防輻射等作用，還可以降壓、降脂、降血糖[2-7]。為了綜合開發(fā)茶葉資源，促進(jìn)恩施州茶葉產(chǎn)業(yè)鏈的有效延伸，增加當(dāng)?shù)夭柁r(nóng)的收入，采用當(dāng)?shù)禺a(chǎn)量大、價(jià)格低廉的茶葉生產(chǎn)廢料提取EGCG，并對其提取工藝進(jìn)行研究，以期更有效地開發(fā)利用茶葉廢料。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料與試劑
　　茶葉生產(chǎn)廢料購于恩施市清江生物有限公司。大孔樹脂：D608、 HPD100、 XDA-1、 D302、 D101B、D609、D103、D102、D4020、DM130、D101、D301、X-5及聚酰胺型樹脂（上海摩速科學(xué)器材有限公司）。
　　EGCG標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100603，含量≥98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司提供）；水為純化水；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。
　　1.2 儀器
　　DIONEX U3000 高效液相色譜儀（Chromeleon色譜工作站），Acclaim 120 C18 5 μm Analytical （4.6 mm×250 mm）色譜柱，VWD3100檢測器； MS105 半微量天平（感量0.01 mg，METTLER TOLEDO）；AL204 分析天平（感量0.1 mg，METTLER TOLEDO）；LGJ-10凍干機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；KQ-2500超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，33 kHz）；UV2600紫外可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；微孔濾膜（有機(jī)系，0.22 μm）。
　　1.3 方法
　　1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取EGCG標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇溶解制成濃度為0.3 mg/mL的溶液，搖勻，微孔濾膜過濾，取濾液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取5、10、15、20、25 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液參照文獻(xiàn)[8]的色譜條件分別測定峰面積，平行測定3次。以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)軸、峰面積A為縱坐標(biāo)軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其線性回歸方程。
　　1.3.2 EGCG測定方法 稱取茶葉生產(chǎn)廢料細(xì)粉0.2 g，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇超聲提取30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取濾液測定峰面積并帶入回歸方程計(jì)算茶葉生產(chǎn)廢料中EGCG的含量。
　　1.3.3 EGCG提取方法 取茶葉生產(chǎn)廢料粗粉10 g置于索氏提取器中，參照文獻(xiàn)[9]的方法提取2次，趁熱抽濾，合并濾液，減壓濃縮至無乙醇味，得茶葉生產(chǎn)廢料提取液。
　　1.3.4 EGCG純化工藝
　　1）樹脂的篩選。對大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理[10，11]，分別量取預(yù)處理好的大孔樹脂10 mL，置250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL已知EGCG濃度的茶葉生產(chǎn)廢料提取液，25 ℃、100 r/min振蕩24 h后取出，測定EGCG吸附量，并計(jì)算比吸附量（比吸附量=EGCG吸附量/樹脂體積）；靜態(tài)吸附完成后，過濾除去茶葉生產(chǎn)廢料提取液，將樹脂重新置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL 95%乙醇以25 ℃、100 r/min振蕩24 h取出，測定EGCG解吸量，計(jì)算解析率（解析率=被解析EGCG量/被吸附EGCG量×100%）。選擇比吸附量大且解析率高的大孔樹脂作為分離純化EGCG的樹脂。
　　2）吸附條件優(yōu)化。改變樣品的濃度、上樣速度對吸附條件進(jìn)行優(yōu)化[10，11]。分別取60 mL篩選出的樹脂裝入3根玻璃柱，充分沉降均勻，將樣品溶液以一定速度通過樹脂柱，前150 mL流出液不收集，后每15 mL收集1份，分別取5 μL測定EGCG峰面積，繪制曲線圖，確定上樣濃度及上樣速度。根據(jù)確定的上樣濃度和上樣速度進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，并測定EGCG峰面積，繪制泄露曲線。
　　3）洗脫條件優(yōu)化。改變乙醇的體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速對洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化[10，11]。按上述確定的吸附條件上柱，吸附平衡后，用2 BV純化水淋洗樹脂柱，后依次用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液以不同的流速淋洗樹脂柱，各濃度淋洗液的量為3 BV。收集淋洗液，每15 mL收集1份，每份淋洗液取5 μL進(jìn)行液相色譜儀分析，測定EGCG峰面積，繪制洗脫曲線，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速對洗脫效果的影響。
　　2 結(jié)果與分析
　　2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
　　線性回歸方程為：A=22.733X-0.5571，r=0.999 8（n=5）。
　　2.2 含量測定
　　采用HPLC分析得到茶葉生產(chǎn)廢料中EGCG的含量為82.42 mg/g。
　　2.3 樹脂的篩選
　　在篩選的14種樹脂中，多種大孔樹脂對茶葉生產(chǎn)廢料中EGCG的比吸附量都較大，但以D101型樹脂為好，從解析率來看，也以D101型樹脂為最好，故確定D101型樹脂為分離純化茶葉生產(chǎn)廢料提取液中EGCG的最佳樹脂。

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