趨磁真菌研究進展_真菌果膠酶的研究進展

　　收稿日期：2006-09-22? 　　作者簡介：黃娟（1981-），女，湖南益陽人，武漢科技大學中南分校生命科學學院教師。? 　　（武漢科技大學中南分校 生命科學院，湖北 武漢 430223）?
　　摘要：果膠酶作為植物病原真菌的重要致病因素之一，近年來研究進展較為迅速。本文闡述了果膠酶的分類、結(jié)構(gòu)、功能、表達、以及基因調(diào)控，同時對果膠酶在植物病程中的作用也進行了介紹。?
　　關(guān)鍵詞：果膠酶；表達；基因調(diào)控?
　　中圖分類號：Q55 文獻標識碼：A??
　　
　　自1966年Bateman和Millar研究了果膠酶在植物細胞壁降解中的作用[3，4]，迄今對果膠酶在各方面的研究進展十分迅速[4]。許多學者利用層析，電泳，放射免疫化學等現(xiàn)代科技手段對果膠酶的生物化學進行了廣泛的研究，明確了一些病原菌果膠酶的氨基酸組成，分子量，同工酶數(shù)量及酶動力學[1，2，3，5]，在遺傳學方面，某些果膠酶的編碼基因已得到克隆，通過質(zhì)粒建立了相應的克隆基因庫，研究了某些果膠酶編碼基因的同源性[4]。在植物病理學方面，為了探索果膠酶在植物病程中的作用，從生理及超微結(jié)構(gòu)上研究了罹病組織內(nèi)果膠酶的活性；許多學者探討了在寄主和寄生物自然變異條件下罹病組織內(nèi)病菌致病性和果膠酶活性之間的相互關(guān)系，利用果膠酶進行了病害癥狀復制，并對果膠酶缺陷型突變株致病性表現(xiàn)型進行了系統(tǒng)的觀察、分析，初步證實了高度純化的果膠酶可以浸解植物細胞壁，病原菌果膠酶的產(chǎn)生及調(diào)控與植物發(fā)病并非是簡單的相互關(guān)系。?
　　
　　一、果膠酶的分類及酶的動力學研究?
　　
　�。ㄒ唬┕�膠酶的種類?
　　根據(jù)酶所催化的反應類型，果膠酶分為水解酶和轉(zhuǎn)消裂解酶兩大類。果膠水解酶類已知有6種，如內(nèi)聚半乳糖醛酸酶（endo-PG），果膠甲酯酶（PME或PE）；轉(zhuǎn)消裂解酶類已知有4種，如內(nèi)果膠甲基轉(zhuǎn)消酶（endoPMTE）或果膠裂解酶（PNL）、內(nèi)聚半乳糖醛酸轉(zhuǎn)消酶（endoPGTE）或果膠酸裂解酶（PL）。果膠酶一般都有兩種形式endo-和exo-，endo-的形式比exo-的形式更有效，因為endo-形式的酶可以以隨機方式作用于底物的a-1，4糖苷鍵的任何部位，生成各種寡聚體的混合物，而exo-形式的酶僅作用于非還原性末端糖苷鍵，生成定量的二聚體，所以在罹病植物中endo-形式的果膠酶多于exo-形式。?
　　1.多聚半乳糖醛酸酶（PG）?
　　曲霉菌ＰＧ最初（1990）從商品的黑曲霉（A.niger）果膠酶分離到5種endoPG 1種exoPG。主要的endoPG為endoPGⅠ和endoPGⅡ，分子量分別為55kDa和38kDa，兩者的等電點、比活、對寡聚底物的作用方式及氨基酸組成全然不同。另外3種endoPG即endoPGⅢA，endoPGⅢB和endoPGⅢC的生理活性與endoPGⅠ極相似。其后從黑曲霉基因組文庫分離出幾個基因，編碼的endoPGE分子量35.6kDa，pI=3.6，最適pH=3.8。endoPGE與endoPGC的AA序列同源性最高，有77.6%相同，與endoPGⅠ和endoPGⅡ的同源性較差，分別為57.6%和54.3%相同[6]。米曲霉（A.oryzae）有2種PG，分子量分別為41kDa和39kDa，最適pH為5.0，最適溫度分別為45℃和55℃[7]。黃曲霉（A.flavus）兩個PG基因即pecA和pecB，前體蛋白預期分子量分別為37.6kDa和38kDa[8]。其它曲霉菌，如 A.ustus的endoPG分子量為36kDa，pI=8.3。A.parasiticus的endoPG基因pecA用黑曲霉pgaⅡ做探針分離到，與其它真菌的PG基因極相似。A.tubigensis的endoPG基因pgaⅡ與 A.niger的pgaⅡ基因的核苷酸序列有83%相同，前體蛋白AA序列94%相同。?
　　灰霉菌（Botrytiscinerea）PG最初從在蘋果果膠上培養(yǎng)的灰霉菌分離得到5種PG同工酶（Ⅰ―Ⅴ），4個酸性，1個堿性，pI分別為9.3、4.9、4.6、3.7、2.7，其中以PGⅢ比活最高，PGⅠ為內(nèi)切酶，另4種為外切酶。后來從灰霉菌引起的蘋果腐敗組織中分離到1種exoPG，表觀分子量為45kDa，pI=4.6，與此菌在液培時產(chǎn)生的同工酶的pI、最適pH和作用方式相似。另用A.niger的pgaⅡ基因做探針從灰霉菌分離到6個endoPG的編碼基因，這6個基因編碼的endoPG前體的氨基酸序列有34―73%相同，可分到3個單源（monophyletic）組中[9]。?
　　鐮孢菌（Fusariumspp.）的PG番茄尖鐮孢（Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici）一種主要胞外endoPG前體蛋白分子量41.1kDa，成熟蛋白推算分子量為35.5kDa，pI=6.2，與F.moniliforme的PG，C.carbonum的PGN1，Ａ.niger的PG，Ａ.oryzae的PG，和S.sclerotiorum的PG1分別有82.9%、29%、27.6%、14.2%和26.9%同源性[10]。?
　　番茄根腐尖鐮孢（F.oxysporumf.sp.radicis.lyc-opersici）在降解果膠時先產(chǎn)生endoPG，以后以exoPG為主。exoPG與其它真菌的endoPG相似程度高[11]。串珠鐮孢（F.moniliforme）也有一種endoPG。?
　　其它真菌的PG菜豆炭疽病菌（Clletotrichumlindermuthianum）已有2個endoPG基因被克隆，其中pg1編碼主要的endoPG，這個基因在病菌腐生時和在侵染植物時都表達。在菜豆壞死組織中檢測到，與細胞壁大量降解有關(guān)，RT-PCR表明在侵染的死體營養(yǎng)階段開始時pg1表達。pg2與pg1AA序列有61%相同，與其它真菌的endoPG有37%-59%相同[12]。?
　　核盤菌（Sclerotinia sclertiorum）的endoPG有多種等電點不同的同工酶，其中pg1是一種中性蛋白，endoPG2和endoPG3的等電點分別為4.8和4.9，分子量相似，氨基酸組成上僅在天冬氨酸，天冬酰胺組成上不同，與PG1氨基酸序列分別有90%和89%相同。用PG3制備的抗體與PG2有交互反應，但不與黑曲霉PG反應。endoPG由多基因家族編碼，7個基因構(gòu)成這個家族的2個亞家族。比較這個基因家族的3個成員的編碼區(qū)的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)差異很小[13]。北方核盤菌（S.borealis）有1種特殊的喜冷endoPG，分子量為40kDa，等電點為7.5，最適pH為4.5，適溫為40―50℃，在5℃仍有30%的活性，60℃時活性弱[14]。?
　　玉米圓斑病菌（Coboluscarbonum）的1個endoPG基因pgn1和1個exoPG基因pgx1已分離到，pgx1產(chǎn)物PGX1前體推算分子量為48kDa，與A.tubingensis的exoPG有61%氨基酸相同。Pgx1突變菌系在果膠上生長慢，對玉米仍致病，pgn1/pgx1雙突變菌系盡管PG活性只及野生型1%，但仍對玉米致病[15]。青霉菌P.oxalicum有2種PG，PGⅠ不太穩(wěn)定，為外切酶，PGⅡ為內(nèi)切酶，活性強，4小時內(nèi)可浸解和殺死木薯組織，在病程中似起主要作用。P.janthnillum和P.griseoroseum各有1種PG[16]。啤酒酵母（Scchato mycescerevisiae）CECT1389菌系一種endoPG表觀分子量39kDa，最適pH為5.5，最適溫度為45℃。啤酒酵母PG與其它真菌的PG有54%同源。與植物和細菌的PG只有24%同源。每個單倍體只有1個單基因拷貝[17]。?
　　脈孢菌（Neurosporacrassa）的endoPG洗脫成單一活性峰，提純的PG為單體糖蛋白（38%CH2O），表觀分子量36.6～37.0kDa，最適pH6.0，最適溫度45℃[18]。栗疫菌（Cryphonectri aparasitica）的成熟蛋白ENPG-1推定分子量為34.5kDa，pI=7.2，與玉米圓斑病菌的endoPG有66%相同[19]。榆枯萎病菌（Ophiostromanovoulmi）也有一種PG。?
　　2.果膠裂解酶（PL）?
　　果膠裂解酶（PL）主要是曲霉菌和鐮孢菌產(chǎn)生PL，此外還有P.oxalicum和啤酒酵母和灰霉菌。從黑曲霉已克隆到6個PL編碼基因，即pelA、pelB、pelC、pelD、pelE和pelF，其中pelA和pelD分別編碼商品果膠酶Ultram的兩種主要PL即PLⅠ和PLⅡ。從茄鐮孢豌豆�；�型（F.solanif.sp.pisi）分離到4個endoPL基因，即pelA、pelB、pelC、pelD[20]。pelA編碼的endoPLA前體蛋白29kDa，成熟蛋白26kDa，pI=8.3，最適pH=9.4。pelB編碼的PLB分子量為25.6kDa，最適pH值10.0。與PLA的AA序列有65%相同，PLA和PLB與其它果膠酶無明顯的同源性。PecC編碼的PLC分子量23.3kDa，與PLA有血清關(guān)系，AA序列與有51%相同，最適pH9.5，活溫55℃。pelD編碼的PLD分子量24.5kDa，成熟蛋白分子量22.7kDa，AA序列與PLA、PLB、PLC分別有49%、44%、65%相同。?
　　番茄尖鐮孢編碼PL1的基因與茄鐮孢豌豆專化型（F.solanif.sp.pisi）的pelA、pelB、pelC、pelD基因分別有89%、67%、55%和56%同[21]。?
　　3.果膠酯酶（PE）?
　　黑曲霉、啤酒酵母和玉米圓斑病菌等菌具有PE，PE去酯化是隨機的。?
　　（二）果膠酶動力學的研究?
　　酶動力學的研究目前集中于endoPG，PME（PE）及其同工酶方面，不同種病菌分離自同一種果膠酶在分子量，最適pH值，pI，氨基酸組成，Km等方面均有所差異，即使從同一種病菌分離的同一種果膠酶，也因?qū)嶒灄l件的不同而不完全一致。一般而言，除PME外，其它果膠水解酶的最適pH值均在4.0―5.0之間，pI偏低，在6.0―8.0之間，而轉(zhuǎn)消裂解酶最適pH值在9.0―9.5之間，pI在8.0―9.0之間，并且容易被二價陽離子激活[5，22]。果膠酶的最適pH值比較穩(wěn)定，這是分離提純兩大類果膠酶的依據(jù)之一。一般果膠酶的最適溫度均在40―53℃。細菌果膠酶復合體中，PL有各種同工酶，pI分別為堿性，酸性，中性[23]；真菌果膠酶復合體中，水解酶有同工酶，如從Botrytis cinerea等真菌分離到的endoPGI，Ⅱ[5、22]。PLb和PLc，PEI和PEⅡ和酶學特性相似，可能是由重復基因編碼所致。Botrytiscinerea的PG和PE符合米氏方程，谷氨酸為PG的競爭性抑制因子。Km和Vmax受鹽濃度影響。?
　　
　　二、真菌果膠酶的結(jié)構(gòu)與功能?
　　
　　真菌果膠酶基因的開放讀碼框（ORF）絕大多數(shù)被內(nèi)含子分隔。內(nèi)含子最多的達7個，兩種已克隆的PE基因都有6個內(nèi)含子。?
　　果膠酶的前體蛋白Ｎ信號肽一般為16～27AA，個別如曲霉菌的PGC有一個較長的N信號肽（40AA），有的PL無N信號肽。?
　　許多果膠酶都有糖基化位點，如串珠鐮孢endoPG前體有4個糖基化位點。關(guān)于酶的活性中心，對24種曲霉PG的分析表明，一個外露的Tyr殘基在pH9.3～9.5時離子化，可能與催化有關(guān)，內(nèi)藏的Tyr殘基與催化關(guān)系密切，在pH10.5時離子化[24]。串珠鐮孢endoPG的His234對酶活性和浸解活性起關(guān)鍵作用，與結(jié)合PG1P無關(guān)，當His234→Lys時無酶活，Ser237和Ser240→Gly時，酶活性分別降低48%和6%。?
　　
　　三、表達與調(diào)控?
　　
　　如前所述，多種真菌的果膠酶已在酵母菌中正確表達。如茄鐮孢豌豆�；�型pelB、pelC、和pelD的cDNA轉(zhuǎn)入一種畢氏酵母（Pichiapastoris）可表達。果膠酶一般受果膠、植物維管組織、低濃度的（0.1%）Ｄ半乳糖醛酸、半乳糖誘導，受葡萄糖、較高濃度（1%）的半乳糖醛酸、抗體、某些抗菌素（如阿莫西林）、植物的PG抑制蛋白（PGIP）抑制。Ca2+抑制一些PG，而一些PL的活性需Ca2+參與個別果膠酶基因組成型表達。?
　　
　　四、真菌果膠分解酶的加工和輸出?
　　
　　真菌果膠酶一般有糖基化位點，功能酶以糖蛋白形式存在。如玉米圓斑病菌pgx1N端有12AA的糖基化位點，糖蛋白分子量60kDa，去糖基后表觀分子量45kDa[15]。核盤菌在多聚半乳糖醛酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的早期分泌的2種endoPG都是糖蛋白。番茄根腐尖鐮孢exoPG的糖基化程度高，糖蛋白形式存在時分子量為66kDa，去糖后50kDa[11]。不過以黑曲霉的endoPC糖基化程度最高。?
　　果膠酶一般輸出到胞外，如啤酒酵母的endoPG。?
　　
　　五、果膠酶在植物病程中的作用?
　　
　　果膠酶在植物中的作用是復雜的，它雖然可以由許多微生物產(chǎn)生。然而，一些微生物即使能在離體條件下產(chǎn)生，但在自然條件下的植物體內(nèi)卻不一定產(chǎn)生。因此能產(chǎn)生果膠酶的微生物不一定就是病原物。要確定在自然生態(tài)條件下果膠酶的作用，必須了解果膠酶產(chǎn)生系統(tǒng)內(nèi)的選擇壓力，而實現(xiàn)這一目標的重要手段就是在其它的寄主和環(huán)境下，探索產(chǎn)生果膠酶的突變株的各種表現(xiàn)型。?
　　在有些病害中，果膠酶的活性與致病性呈正相關(guān)，但也有不少事實證明果膠酶的活性與致病性無關(guān)，所以有人提出果膠酶可能是在病程中，病害復合體的諸因素之一，也就是說病菌的致病性可能還有其它必要的基因控制，也有人認為果膠代謝在植物病程中不是必須的，果膠酶的誘導產(chǎn)生只是對植物內(nèi)部效應因子的反應�？傊�，對于果膠代謝在植物病程中的作用有待進一步探索。有些病菌（尤其是真菌）盡管在不同的植物細胞壁上生長速度不同，但這種生長速度的差異與果膠酶的產(chǎn)生或寄主一寄生物相互親合性無關(guān)。因而每種病菌與寄主的關(guān)系不能簡單化和通用化。?
　　
　　六、結(jié) 語?
　　
　　真菌果膠酶的多樣性使我們在利用果膠酶時有了更大的選擇余地。對于一些產(chǎn)果膠酶也產(chǎn)致癌毒素如黃曲霉素的真菌，可將其果膠酶基因轉(zhuǎn)入不產(chǎn)毒素的真菌如酵母菌和米曲霉中。為得到單一的果膠酶，可將其基因克隆到不產(chǎn)果膠酶的相近真菌中。用強啟動子如TEF1α啟動子取代果膠酶基因原有的啟動子或在果膠酶的發(fā)酵生產(chǎn)中加入果膠酶誘導物可用以提高產(chǎn)量，而在果實貯藏期間可用果膠酶抑制物處理或轉(zhuǎn)PGIP基因入植物可防軟化。富含果膠的物質(zhì)如蘋果渣既是果膠酶誘導物和底物，也是果膠酶的良好載體。北方核盤菌喜冷endoPG的發(fā)現(xiàn)為果膠物質(zhì)的低溫降解提供了可能。在許多重要植物病害中，果膠酶是重要的致病因素之一。真菌果膠酶的進一步研究將有助于更合理地利用果膠酶。?
　　
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