基于核酸適配體-金納米粒子比色傳感器快速檢測食品中赭曲霉毒素A

　　摘 要：本研究以核酸適配體為識別元件實現(xiàn)對赭曲霉毒素A（OTA）的高選擇性識別，以及采用金納米粒子做為比色探針，建立了適用于OTA快速檢測的比色適配體傳感器。研究結(jié)果表明，該比色傳感器對OTA具有較高的靈敏度和特異性，操作簡單快速，能用于實際食品樣品中OTA的快速篩查檢測；該比色傳感器在520nm和650nm下吸光度的比值（A520/A650）與OTA濃度在0.05～5μM的范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，檢測限為0.02μM。
　　關(guān)鍵詞：核酸適配體 金納米粒子 比色傳感器 赭曲霉毒素A
　　前言
　　赭曲霉毒素是由多種曲霉和青霉菌產(chǎn)生的一類化合物，包括赭曲霉毒素A、B、C、D，4種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中毒性最大、與人類健康關(guān)系最密切、對農(nóng)作物的污染最重、分布最廣的是赭曲霉毒素A（OTA）[ 1 ]。OTA以污染糧谷類農(nóng)作物為主，但相繼有報道指出，許多其他種類的食品中也檢測出了OTA，如水果、葡萄酒、啤酒、咖啡、可可和巧克力、中草藥、調(diào)味料等多種植物產(chǎn)品和食品。由于生物蓄積作用，如許多動物性食品尤其是腎臟、肝臟、肌肉、血液，以及乳和乳制品中常有OTA檢出[ 2 ]。
　　OTA在食品中的含量通常較低，但較低含量時就可危害人體健康，因此建立一種具有一定靈敏度與專一性，且簡便實用，便于推廣的OTA快速檢測方法具有重要意義。目前應(yīng)用最廣泛的OTA檢測方法是高效液相色譜法（HPLC）及高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[ 3 ]，但這些方法存在著前處理復(fù)雜，樣品提取繁瑣、凈化過程及檢測周期長、儀器昂貴、檢測成本高等缺點，而無法用于大量樣本的快速篩查。
　　核酸適配體是新近發(fā)展起來的一類由指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX）篩選產(chǎn)生的單鏈DNA或RNA片段，能特異性地結(jié)合小分子蛋白質(zhì)、多肽、有機物、金屬離子等各種配體，其作為識別分子在醫(yī)療診斷、環(huán)境檢測、基礎(chǔ)分析等多種技術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用。金納米粒子具有獨特的光學(xué)特性，小粒徑金納米粒子（10～100nm）水溶膠一般呈紅色，當金納米粒子由于外在的作用發(fā)生聚集時，其吸收峰將變寬并發(fā)生紅移，其顏色也由紅色變?yōu)樗{紫色。依據(jù)這一現(xiàn)象，將以核酸適配體為識別元件與以金納米粒子為比色探針相結(jié)合，構(gòu)建的適配體比色探針廣泛地用于各種生化檢測，檢測目標包括生物大分子、癌細胞、金屬離子以及有機小分子[4]。
　　本研究開發(fā)了一種“雙鏈復(fù)合物”模式的比色探針，通過核酸適配體將金納米粒子連接在一起發(fā)生團聚，隨著OTA與核酸適配體的結(jié)合，DNA鏈發(fā)生解鏈，連接在一起的金納米粒子由于靜電作用重新分散于溶液中，溶液顏色相應(yīng)發(fā)生改變，從而實現(xiàn)食品中OTA的快速靈敏檢測。
　　1 實驗部分
　　1.1 儀器和試劑
　　UV-2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；XS105DU型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q純水機（美國Millipore公司）。
　　氯金酸（HAuCl4）為分析級，購自于美國Sigma公司；赭曲霉毒素A購自于美國Romer公司；甲醇（HPLC級，德國Merck公司）；其余試劑均為分析純，實驗用水是超純水（>18 MQ）。
　　包含核酸適體的DNA寡聚核苷酸（連接鏈）和兩條與之部分互補的DNA寡聚核苷酸（分別在3’端和5’端進行巰基修飾）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列如下：
　　連接鏈（粗斜體為OTA適配體部分）：5’-ACTCATCTGTGAAGA？GATCGGGTGTGGGTGGCG TAAAGGGAGCATCGGACA -3’；5’端巰基化DNA：5’-HS-CACCCGATCTCT-3’；3’端巰基化DNA：5’-TCACAGATGAGTA10-SH-3’；使用前3種DNA鏈分別用水溶解，配制成100μM的溶液。
　　1.2 金納米粒子的制備
　　利用檸檬酸鈉還原法合成實驗用的金納米粒子。具體方法如下：將100mL新鮮配制的1mM的HAuCl4溶液加入到錐形瓶中，于恒溫電磁攪拌器上加熱沸騰2min，然后迅速加入2mL質(zhì)量分數(shù)為5%的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌，加熱保持沸騰10min，使溶液的顏色由淡黃色變?yōu)榫萍t色，停止加熱，攪拌使其冷卻至室溫，然后將制備的納米金溶液裝入棕色試劑瓶中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?img src="http://img1.qikan.com.cn/qkimages/spaq/spaq201803/spaq20180327-1-l.jpg" />
　　1.3 核酸適配體-金納米粒子探針的制備
　　取5’端巰基化DNA以及3’端巰基化DNA的溶液各100μL加入10mL納米金溶液中，攪拌均勻后，在室溫下放置12h，使DNA鏈通過Au-S鍵結(jié)合到納米金表面，再加入100μL的包含核酸適配體連接鏈溶液，混合均勻后，將溶液加熱至94℃ 2min，快速冷卻至30℃，保持30min，使包含核酸適配體連接鏈與納米金表面結(jié)合的DNA雜交。然后在16000rpm下離心15min，以去除多余的、沒有和納米金結(jié)合的DNA鏈，加水清洗后再次離心，將制備的核酸適配體-金納米粒子探針用10mL濃度為20mM pH=8.5的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）分散，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　1.3 核酸適配體-金納米粒子比色探針對OTA的檢測
　　OTA標準溶液：用甲醇將OTA溶解配制成1mM的標準儲備溶液，臨用前用PBS稀釋成不同濃度的測試液。
　　實際樣品中OTA的提�。簩⒉缓琌TA的玉米樣品徹底粉碎后，加入不同濃度的OTA樣品，充分混勻。稱取5g加標樣品，加入20mL 80%的甲醇水溶液作為提取液，渦旋混勻后震蕩提取30min，離心后將上清液用氮氣吹干，加入200μL甲醇溶解后，加PBS緩沖溶液稀釋至1mL，通過0.45μm的微孔濾膜過濾后作為測試液。
　　OTA測定：將500μL核酸適配體-金納米粒子探針加入測試管中，再加入500μL待測液，用振蕩器混勻，靜置反應(yīng)15min分鐘，即可用肉眼觀察顏色變化，實現(xiàn)對OTA的快速定性檢測，用紫外可見分光光度計掃描反應(yīng)后的溶液，利用加入OTA后吸光度的變化，實現(xiàn)對OTA的快速定量檢測。

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