蝦肝腸胞蟲LAMP檢測(cè)方法的建立

　　摘 要 為建立一種快速檢測(cè)蝦肝腸胞蟲（EHP）的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP），根據(jù)GenBank中登錄的EHP-SSU基因序列設(shè)計(jì)了6條LAMP特異性引物，經(jīng)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了EHP-LAMP檢測(cè)方法。該方法的檢出限為3.71個(gè)質(zhì)�？截�/μL；與對(duì)蝦其他常見病毒病的病原（WSSV、IHHNV、CMNV）均無交叉反應(yīng)。使用LAMP方法和普通PCR方法對(duì)30份具有典型EHP感染癥狀的對(duì)蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：LAMP和PCR方法的陽(yáng)性檢出率均為100%。表明建立的EHP-LAMP方法具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn)，適用于生產(chǎn)中對(duì)蝦肝腸胞蟲的快速早期診斷，為EHP的防治提供技術(shù)支撐。
　　關(guān)鍵詞 對(duì)蝦；肝腸胞蟲；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；檢測(cè)
　　中圖分類號(hào)：S945.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.09.058
　　1 材料與方法
　　1.1 試驗(yàn)材料和儀器設(shè)備
　　采自天津市東麗區(qū)華明街胡張莊村的南美白對(duì)蝦樣品，具有典型的EHP感染癥狀，經(jīng)PCR檢測(cè)并測(cè)序后確認(rèn)為EHP感染，由本實(shí)驗(yàn)室保存；經(jīng)檢測(cè)未感染EHP的對(duì)蝦基因組、僅感染對(duì)蝦白斑病毒（WSSV）的對(duì)蝦基因組、僅感染對(duì)蝦皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）的對(duì)蝦基因組、僅感染偷死野田村病毒（CMNV）的對(duì)蝦RNA均由本單位病原檢測(cè)室提供；海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（天根生物）；10 mM dNTP、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自大連寶生物（TakaRa）；Bst DNA聚合酶（NEB）、鈣黃綠素染料（北京藍(lán)譜）、甜菜堿（Sigma）。PCR儀（ABI）、凝膠成像系統(tǒng)（Biometra）、金屬�。ㄌ旄�生物）、離心機(jī)（Sigma）、電泳儀（北京六一）[1]。
　　1.2 方法
　　1.2.1 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成
　　根據(jù)GenBank發(fā)布的EHP基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)資料，選取EHP-SSU（登錄號(hào)：FJ496356.1）為靶基因，按照LAMP引物設(shè)計(jì)原則，使用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version 5 （http：//primerexplorer.jp/e）設(shè)計(jì)6條引物，分別為外引物F3/B3，內(nèi)引物FIP/BIP和環(huán)引物L(fēng)F/LB，引物由上海生工合成[2]。
　　1.2.2 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化
　　按照海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取感染EHP對(duì)蝦的基因組DNA，作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增反應(yīng)的模板。EHP-LAMP的基礎(chǔ)反應(yīng)體系（25μL）：2.5μL 10×Bst DNA聚合酶buffer，3.5μL 10 mM dNTP，1.5μL 100 mM MgSO4，0.4μL 100 μM FIP，0.4 μL 100 μM BIP，0.2μL 100 μM LF，0.2μL 100μM LB，0.05μL 100 μM F3，0.05μL 100μM B3，8 U Bst DNA聚合酶，1μL鈣黃綠素染料，3μL 5 M甜菜堿，滅菌水適量，2μL模板�；�礎(chǔ)反應(yīng)條件為63 ℃ 60 min，80 ℃ 10 min。為了得到最佳擴(kuò)增效果，在基礎(chǔ)反應(yīng)體系上對(duì)其可能影響較大的試劑，如甜菜堿、dNTP、MgSO4、Bst DNA聚合酶等的用量以及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的靈敏度試驗(yàn)
　　將用于EHP-LAMP引物設(shè)計(jì)的SSU基因序列與pUC57載體連接，構(gòu)建SSU-pUC57質(zhì)粒，質(zhì)粒構(gòu)建工作由上海生工完成。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取SSU-pUC57質(zhì)粒，利用核酸檢測(cè)儀測(cè)定所提取質(zhì)粒的初始濃度，根據(jù)公式：質(zhì)�？截悢�(shù)/μL=質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量×阿佛加德羅常數(shù)，計(jì)算出SSU-pUC57質(zhì)�？截悢�(shù)為3.71×109，用滅菌水按10倍遞進(jìn)稀釋法將質(zhì)粒稀釋至3.71個(gè)質(zhì)�？截�/μL，取2μL各濃度稀釋液分別進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增（以F3/B3為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為191 bp），比較兩種方法的最低檢測(cè)量。
　　1.2.4 LAMP反應(yīng)體系的特異性試驗(yàn)
　　將天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心病原檢測(cè)室提供的僅感染W(wǎng)SSV的對(duì)蝦基因組、僅感染IHHNV的對(duì)蝦基因組、僅感染CMNV的對(duì)蝦RNA（反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板）以及感染EHP的對(duì)蝦基因組，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照（SSU-pUC57質(zhì)粒），按照上述建立的LAMP方法進(jìn)行EHP-LAMP檢測(cè)體系的特異性分析。
　　1.2.5 臨床樣品的檢測(cè)
　　同時(shí)利用本研究建立的EHP-LAMP檢測(cè)技術(shù)和PCR方法，分別對(duì)挑選30尾具有典型感染EHP癥狀的對(duì)蝦進(jìn)行檢測(cè)，并將這兩種方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較。
　　2 結(jié)果
　　2.1 EHP-LAMP的優(yōu)化結(jié)果
　　經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，發(fā)現(xiàn)甜菜堿、MgSO4和dNTP的加入量對(duì)EHP-LAMP反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率影響較大。最終確定EHP-LAMP的最佳反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×Bst DNA聚合酶buffer，2.5 μL 10 mM dNTP，2 μL 100 mM MgSO4，0.4 μL 100 μM FIP，0.4 μL 100 μM BIP，
　　0.2 μL 100 μM LF，0.2 μL 100 μM LB，0.05 μL 100μM F3，0.05 μL 100μM B3，8 U Bst DNA聚合酶，1 μL鈣黃綠素染料，1 μL 5M甜菜堿，2 μL模板滅菌水定容總體積至25 μL。反應(yīng)條件為63 ℃ 40 min，80 ℃ 5 min。
　　2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果
　　利用優(yōu)化條件后的EHP-LAMP和PCR檢測(cè)方法對(duì)不同稀釋倍數(shù)的模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示：LAMP檢測(cè)方法的檢出限為3.71個(gè)質(zhì)�？截�/μL，PCR檢測(cè)方法的檢出限為371個(gè)質(zhì)�？截�/μL，LAMP檢測(cè)方法的靈敏度高于PCR。

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