川芎藥材HPLC指紋圖譜研究

　　摘要：目的 建立川芎藥材的高效液相色譜指紋圖譜。方法 使用色譜柱Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm。通過(guò)提取11個(gè)色譜峰作為指紋圖譜共有峰，分別采用相似度評(píng)價(jià)，聚類分析和主成分分析等方法，對(duì)所收集的18批樣品進(jìn)行系統(tǒng)比較與歸類。結(jié)果 通過(guò)比較18批川芎的色譜圖，確定了11個(gè)共有峰，大部分樣品的相似度在0.9以上，并將不同川芎分為3大類。結(jié)論 該方法重復(fù)性好，簡(jiǎn)便可靠，可以為川芎的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。
　　關(guān)鍵詞：川芎；指紋圖譜；高效液相色譜法
　　中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2014）04-0086-04
　　川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，主要栽培于四川、云南、貴州、廣西、湖北等地。川芎始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛、微苦、性溫，具有活血祛瘀、行氣開(kāi)郁、祛風(fēng)止痛之功，用于血瘀氣滯所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉，肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛，風(fēng)寒濕痹、跌打腫痛等[1-2]。
　　現(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明，川芎的活性成分主要包括揮發(fā)油類、酚酸類和生物堿類[3-4]，川芎的質(zhì)量和道地性均與活性成分的含量和種類緊密相關(guān)。中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)一直是中藥研究與應(yīng)用中的難點(diǎn)與重點(diǎn)問(wèn)題，而建立在中藥成分系統(tǒng)研究基礎(chǔ)上的中藥指紋圖譜分析是一種綜合、有效的評(píng)價(jià)手段，已成為國(guó)際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量最有效的方法之一[5-8]。為了更深入地研究并揭示川芎的質(zhì)量差異，本試驗(yàn)對(duì)18個(gè)批次的川芎藥材采用高效液相色譜法（HPLC）并結(jié)合“中藥材指紋圖譜相似系統(tǒng)”和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，從而評(píng)價(jià)川芎藥材的質(zhì)量。 1 儀器與試藥
　　美國(guó)Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器Prominence SIL-20A，二極管陣列檢測(cè)器Waters2998和柱溫箱CTO-20A；Thermo C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；Anke TGL-16C高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電子分析天平（FA1204B，上海精密科學(xué)有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-2K6，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。
　　阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773-200611，純度≥98%，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所），甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），純凈水（杭州娃哈哈有限公司）。川芎對(duì)照藥材（批號(hào)120927-200604，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）。川芎藥材共18個(gè)批次，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金老師鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，密封保存于陰涼干燥處。樣品來(lái)源見(jiàn)表1。
　　2 方法與結(jié)果
　　2.1 色譜條件
　　色譜柱：Thermo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：10%A（0 min）～48%A（36 min）～80%A（70 min）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：323 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。
　　2.2 對(duì)照品溶液制備
　　精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸328 μg的溶液，即得。
　　2.3 供試品溶液制備
　　精密稱取川芎粉末2.0 g，置圓底燒瓶中，加入甲醇30 mL，于70 ℃水浴中加熱，冷凝回流提取1 h，放冷，過(guò)濾，殘?jiān)�同法再提�?次，過(guò)濾，合并2次濾液，水浴揮干，用甲醇溶解并定容至10 mL，14 000 r/min離心5 min，吸取上清液，過(guò)0.45 ?m濾膜，即得。
　　2.4 方法學(xué)考察
　　2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，考察阿魏酸色譜峰保留時(shí)間和峰面積的一致性，均RSD<3.0%，說(shuō)明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的要求。
　　2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S9供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣10 ?L，依法測(cè)定，以阿魏酸保留時(shí)間和峰面積計(jì)算，結(jié)果均RSD<3.0%。表明川芎樣品在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
　　2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S9樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以阿魏酸保留時(shí)間和峰面積計(jì)算，結(jié)果均RSD<3.0%，表明本方法重復(fù)性良好，
　　2.5 指紋圖譜測(cè)定
　　取18批川芎藥材，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄60 min色譜圖。通過(guò)比較18批川芎的色譜圖，確定了11個(gè)共有峰，其中4號(hào)峰為阿魏酸。結(jié)果見(jiàn)圖1。
　　2.6 指紋圖譜的建立與分析
　　2.6.1 參比峰的選擇 在各批次樣品圖譜中，4號(hào)色譜峰（阿魏酸）分離度較好，峰面積適中，且為各樣品共有，故選擇4號(hào)峰為參照峰。
　　2.6.2 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將18批川芎樣品色譜圖導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版），通過(guò)多點(diǎn)校正法對(duì)色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成川芎提取物的色譜指紋圖譜共有模式（見(jiàn)圖2），并在分析檢驗(yàn)?zāi)Ｊ较拢�以樣品S1圖譜作為參照?qǐng)D譜，計(jì)算相似度（見(jiàn)表2）。結(jié)果顯示，2號(hào)樣品的相似度<0.9，其他產(chǎn)地的川芎藥材相似度均≥0.9。
　　2.6.3 聚類分析 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的系統(tǒng)聚類法中的組間連接法，對(duì)川芎HPLC指紋圖譜共有峰的峰面積進(jìn)行分析，選取平方歐氏距離作為樣品測(cè)度。利用此方法對(duì)18批川芎進(jìn)行綜合系統(tǒng)聚類分析，聚類分析圖反映的是各樣品的相似程度，樣品間的分類距離值越大則表明各樣品差異性越大。當(dāng)分類距離取11時(shí)，18類川芎樣品被分為3類：第Ⅰa類為樣品S3、S15、S5、S10、S12、S13、S14、S6、S11、S7，第Ⅱa類為樣品S9、S17、S18、S8、S16、S2、S1，第Ⅲa類為樣品S4。

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