12種藏醫(yī)常用藥材抗結(jié)核分枝桿菌活性篩選

　　摘要：目的 觀察12種藏醫(yī)常用藥材對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的體外抗菌活性。方法 取適量的12種藏醫(yī)常用藥材制備其水及/或乙醇粗提物，比例法檢測(cè)各粗提物對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的抗菌MIC。結(jié)果 試驗(yàn)藥材中紅花的水及乙醇粗提物MIC分別為5.86 mg/ml和0.74mg/ml，對(duì)H37Rv抗菌活性最強(qiáng)。唐古特青蘭、藏墊雪靈芝和短穗兔耳草的水提取物具有較明顯的抗菌活性，MIC分別為18.75mg/ml、18.75mg/ml和46.88mg/ml。其他各藥材抗菌活性較弱，其MIC均大于50mg/ml。結(jié)論 所試12種藏醫(yī)常用藥材中紅花、唐古特青蘭、雪靈芝和短穗兔耳草均具有不同程度的體外抗結(jié)核分枝桿菌活性。
　　關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；藏藥；藥物敏感性試驗(yàn)
　　結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染病，由于耐藥及耐多藥結(jié)核分枝桿菌（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）的出現(xiàn)， 結(jié)核病合并HIV感染以及人群流動(dòng)性增加等原因， 結(jié)核病在全球的流行再次呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)[1]。自上世紀(jì)四十年代第一個(gè)抗結(jié)核分枝桿菌藥物-鏈霉素及其后的異煙肼、利福平等藥物應(yīng)用于臨床以來， 雖然人們已研發(fā)出近20種抗結(jié)核分枝桿菌的藥物， 但均存在副作用大， 易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)[2]，而且新藥物的研發(fā)遠(yuǎn)不及細(xì)菌耐藥性形成的速度。因此，從豐富的傳統(tǒng)中藥資源中尋找有效的抗結(jié)核藥物，受到人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾暋?br>　　為了尋找具有明顯抗結(jié)核分枝桿菌的天然藥物用于臨床結(jié)核病的治療，本研究對(duì)12種藏醫(yī)常用藥材進(jìn)行了體外抗結(jié)核分枝桿菌H37RV菌株的藥物敏感性試驗(yàn)，現(xiàn)將初步篩選結(jié)果報(bào)告如下：
　　1資料與方法
　　1.1 一般資料 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（ATCC27294），國家疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)，西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室真空冷凍保存。
　　1.2試驗(yàn)藥材 試驗(yàn)用藏藥材樣品產(chǎn)地、來源、鑒定人、藥用部位及提取溶媒見表1。
　　1.3培養(yǎng)基 改良羅氏培養(yǎng)基。制備方法參考"結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程"進(jìn)行[3]。
　　1.4實(shí)驗(yàn)方法
　　1.4.1試驗(yàn)樣品的制備 稱取各藥材粗粉適量，1：10加入1000ml純水或乙醇，室溫下浸泡24h，60～70℃回流提取3次，2h/次，濾除藥渣，合并濾液，濾液60～70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適當(dāng)體積或浸膏，部分藥物浸膏以真空冷凍干燥至粉末。不同樣品提取用溶劑見表1。取各藥物提取物適量，以滅菌0.5%吐溫-80生理鹽水溶解即為試驗(yàn)藥物原液，-80℃存放備用。部分提取物加入適量吐溫-80助溶。試驗(yàn)藥物原液使用時(shí)以滅菌0.5%吐溫-80生理鹽水2倍稀釋成若干稀釋度使用。
　　1.4.2藏藥培養(yǎng)基的制備 基礎(chǔ)培養(yǎng)基仍采用改良羅氏培養(yǎng)基， 改良羅氏培養(yǎng)基中的水分以試驗(yàn)藥物原液及稀釋液代替， 孔雀綠溶液的配制、全卵液的勻化、培養(yǎng)基的凝固及保存等同改良羅氏培養(yǎng)基的制備。
　　1.4.3菌懸液制備 刮取改良羅氏培養(yǎng)基表面生長2w之結(jié)核分枝桿菌H37RV培養(yǎng)物（需刮取斜面各個(gè)部分的培養(yǎng)物）置于磨菌器底部，使用磨菌棒研磨使呈乳酪狀，以滅菌0.5%吐溫-80生理鹽水稀釋，與1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷�，即配�?mg/ml的菌懸液。
　　1.4.4接種與培養(yǎng) 將1mg/ml的菌懸液10倍稀釋至10-2mg/ml。以滅菌吸管準(zhǔn)確吸取菌液0.1ml分別接種于含藥培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，每管接種菌量為10-3mg。置37℃培養(yǎng)，4w后觀察結(jié)果。待空白對(duì)照管菌落生長至培養(yǎng)基斜面1/3以上時(shí)終止培養(yǎng)，對(duì)照培養(yǎng)基菌落在200以下者不納入研究范圍。
　　1.4.5計(jì)算耐藥百分比 （含藥培養(yǎng)基表面生長菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基表面生長菌落數(shù)）×100%， 若耐藥百分比小于1%， 則認(rèn)為受試菌對(duì)該濃度藥物敏感，反之則為不敏感。
　　2結(jié)果
　　12種試驗(yàn)藥物水和/或乙醇粗提物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的最低抑制濃度（ minimal inhibitory concentration， MIC ）結(jié)果見表1。結(jié)果表明，12種試驗(yàn)藥材中紅花的水和乙醇粗提物MIC分別為5.86mg/ml和0.74mg/ml，對(duì)H37Rv的抗菌活性最強(qiáng)，且80%乙醇粗提物活性優(yōu)于水提取物。其次，具有較明顯抗菌活性的依次為唐古特青蘭、藏墊雪靈芝和短穗兔耳草的水提取物，其MIC分別為18.75mg/ml、18.75mg/ml和46.88mg/ml。其他各藥活性較弱，其MIC均大于50 mg/ml，其中螃蟹甲和烏雙龍膽在試驗(yàn)藥物的第一個(gè)稀釋度即無抗菌活性。
　　3討論
　　我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥對(duì)結(jié)核病的治療已有2000余年的歷史。藏醫(yī)藥是我國民族醫(yī)藥的一枝奇葩，不僅對(duì)疾病具有獨(dú)特的認(rèn)識(shí)和用藥習(xí)慣，而且由于西藏地處青藏高原，常年高寒缺氧、紫外線輻射強(qiáng)，日照充足、空氣干燥，這些獨(dú)特的生境可能促使藏醫(yī)藥用植物產(chǎn)生具有更高藥理活性的成分，甚至獨(dú)有的藥理活性成分。
　　本實(shí)驗(yàn)嘗試從藏醫(yī)臨床常用藥材中初步篩選體外具有抗結(jié)核分枝桿菌活性的藏醫(yī)用藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在所選試驗(yàn)藥物中大部分具有不同程度的體外抗菌活性，其中尤以紅花作用最為明顯，此與宋玉宗等[4]的報(bào)道相一致，但其作用稍弱，其可能原因?yàn)槲覀儗?shí)驗(yàn)所采用的方法為絕對(duì)濃度法，而其為液體稀釋法，前者不及后者對(duì)藥物濃度的測(cè)試精準(zhǔn)。
　　唐古特青蘭、藏墊雪靈芝、短穗兔耳草均為藏醫(yī)常用藥材，有研究顯示三者均具有一定的體外抗菌活性。短穗兔耳草主要用于發(fā)熱、腎炎、肺病、引道流黃黑色液物等疾病[5]，張忠以及楊云裳[6]研究顯示其粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌及熒光假單胞菌都有抑菌活性，MIC最低可達(dá)0.05g/ml；雪靈芝是一種重要的民間草藥， 常用于治療感冒、肺炎、黃疸、風(fēng)濕癥、淋巴結(jié)核、腎結(jié)石、子宮病等[7]，鮑敏等[8]采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)試雪靈芝的水及乙醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、梭狀桿菌等均有不同程度的抑制作用。另外，也有研究提示唐古特青蘭亦具有一定的抗菌活性[9]。但有關(guān)這三種常用藥材抗結(jié)核分枝桿菌的情況則未見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中三者的水提取物均表現(xiàn)有較好的抗菌活性。雖然紫金標(biāo)、草木犀[10，11]等其余藥材也有文獻(xiàn)顯示具有抗菌活性，但在本實(shí)驗(yàn)中顯示的抗菌活性均較低。

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