快速PCR方法在蛇類藥材真?zhèn)舞b別中的應用

　　[摘要]為優(yōu)化獲得一種準確、快速、高效鑒別藥典所載蛇類藥材（烏梢蛇，金錢白花蛇，蘄蛇）真?zhèn)纹返姆椒�。該研究以蛇類藥材經典PCR鑒定方法為基礎，采用堿裂解法提取基因組總DNA，加入特異性PCR引物，采用兩步法進行PCR擴增，從而對蛇類藥材及其混淆品進行鑒別。通過對影響PCR反應時間的退火溫度、變性溫度、退火時間、變性時間、循環(huán)次數(shù)等因素進行優(yōu)化，并對不同型號PCR儀和Taq酶進行考察，分別獲得烏梢蛇、金錢白花蛇、蘄蛇快速PCR反應程序。在PCR產物中加入SYBR Green I染料，正品顯示出明亮綠色熒光，而混淆品不顯示熒光。所建立的蛇類藥材快速PCR真?zhèn)螜z測方法可在30～45 min完成，為蛇類藥材現(xiàn)場快速鑒定提供技術支持。
　　[關鍵詞]快速PCR；蛇類中藥材；分子鑒定；熒光檢測
　　蛇類藥材一直是動物藥重要的組成部分，多具祛風、通絡、止痙功效，臨床應用較為廣泛。《中國藥典》2010年版中共收載了3種蛇類藥材：烏梢蛇Zaocysd humnades，金錢白花蛇Bungarus multicinctus，蘄蛇Agkistrodon acutus。近年來，由于野生資源逐漸匱乏，加上價格昂貴，市場上出現(xiàn)蛇類偽品和混淆品甚多，且僅憑外部形態(tài)特征難以準確辨認^[1]。隨著分子鑒定技術的引入，藥典鑒別項下增加了烏梢蛇、蘄蛇的PCR鑒定，但由于藥典所載方法用時較長，無法適應當前中藥分子鑒定技術現(xiàn)場運用的需要^[2]。
　　PCR作為分子生物學中應用最廣泛的技術之一，隨著研究和應用領域的不斷增長，存在著相當巨大的改進空間。自Millus等^[3]發(fā)明PCR技術以來，對PCR技術的改良從未停止過。Yap等^[4]通過調整PCR條件來縮短PCR反應時間。Wittwer等^[5-6]通過熱空氣注入法快速控溫，從而減少升降溫的時間，并提出了快速PCR（rapid PCR）的概念。
　　快速、準確、高通量鑒別是現(xiàn)代中藥分子鑒別的核心需要，本文基于烏梢蛇、蘄蛇藥典PCR鑒定方法和已建立的金錢白花蛇PCR鑒定方法^[7]，對這3種蛇類藥材PCR鑒別技術的反應程序進行了優(yōu)化，建立了快速PCR鑒別方法，并引入了熒光染料法對真?zhèn)舞b別結果進行檢測，同時結合藥材DNA快速提取技術^[8]，可將蛇類藥材真?zhèn)舞b別時間控制在30 min左右，為實現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用提供技術支撐。
　　1 材料
　　1.1 蛇類藥材 選取來自于不同產地的11批烏梢蛇正品、12批金錢白花蛇正品、8批蘄蛇正品及其33批混偽品進行快速PCR研究。蛇類樣品收集自廣東、江西、北京、安徽等地區(qū)，由中國食品藥品檢定研究院中藥標本館張繼研究員鑒定，憑證標本保存于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心，見表1。
　　1.2 儀器 GeneAmp 9700型PCR擴增儀（Applied Biosystem公司）； TC-512梯度PCR儀（TECHNE公司）；VeritiTM 96孔梯度PCR擴增儀（Applied Biosystems公司）；5810 R 型高速冷凍離心機（Eppendorf公司）； VORTEX-2 GENIE漩渦震蕩儀（Scientific industries 公司）；DYY-12 型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）； HE99X-15-1.5型電泳槽（Hoefer公司）；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)（GENE公司）； ZF-7A型手持式紫外燈（上海谷村電子光學儀器廠）。
　　1.3 試劑 瓊脂糖購自Promega公司；溴化乙啶購自Fluka公司；rTaq DNA聚合酶、SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；AptaTaq fast DNA 聚合酶Mix購自Roche有限公司、Transfast Taq DNA聚合酶購自Transgen有限公司；10 000× SYBR Green I購自Invitrogen公司；其他試劑均為國產分析純。
　　2 方法
　　2.1 基因組總DNA的提取 取20 mg蛇類藥材粉末，使用堿裂解法^[8]提取總DNA，所提取DNA稀釋10倍用于PCR反應。通用引物對Cytb-H /Cytb-L用于PCR反應以檢測DNA質量，25 μL PCR反應體系，包含2.5 μL 10× buffer，1 μL 10 mmol·L^-1dNTPs，0.25 μmol·L^-1上游及下游引物、0.25 U SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、1 μL 20% PVP 40溶液、0.5 μL 10 g·L^-1 BSA溶液、1 μL （約10 ng） DNA 模板，反應程序見表2。
　　2.2 PCR擴增條件的確定 取樣品DNA用于確定快速PCR反應條件。25 μL PCR反應體系，包含2.5 μL 10× buffer，1 μL 10 mmol·L^-1dNTPs，0.25 μmol·L^-1上游及下游引物，0.25 U SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、1 μL 20% PVP 40溶液、0.5 μL 10 g·L^-1 BSA溶液、1 μL（約10 ng）DNA 模板。PCR反應在GeneAmp 9700型PCR擴增儀上進行，初始反應程序見表2。反應結束后取PCR反應產物5 μL，加入2 μL 6× Loading buffer （Takara 公司） 混勻后于EB染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。
　　分別利用蛇類特異性鑒別引物對WuShao-F/WuShao-R，JinQian-F/JinQian-R，QiShe-F/QiShe-R進行PCR反應，并考察退火溫度：61，63，65，67，69，71 ℃（烏梢蛇，蘄蛇）；60，62，64，66，68，70 ℃（金錢白花蛇）；PCR循環(huán)數(shù)：30，28，26，24，22個循環(huán)；變性溫度：94，92，90，88，86，84 ℃；變性和退火時間：20，10，5，3，1 s；Taq酶種類：r Taq DNA聚合酶，SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，AptaTaq fast DNA 聚合酶Mix，TransfastTaq DNA聚合酶；不同PCR儀：9700型PCR儀（ABI公司），VeritiTM 96孔梯度PCR擴增儀（Applied Biosystems公司），TC-512型PCR儀（TECHNE公司）。

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