葛根芩連方中多成分腸滲透性的原藥材歸屬研究

　　[摘要] 中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）構(gòu)建的復(fù)雜層面為中藥復(fù)方研究，在堅(jiān)持多成分同時(shí)測定的前提下，開展?jié)B透性研究時(shí)，其首要任務(wù)是明確透過腸壁而被吸收的成分來源，即具體歸屬于中藥復(fù)方中的哪味藥材。該研究利用化學(xué)成分指紋圖譜技術(shù)（chemical fingerprint），采用離體翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)技術(shù)對經(jīng)典名方葛根芩連方中的腸滲透多成分進(jìn)行直觀來源歸屬，為下一步的腸滲透性定性及定量研究奠定基礎(chǔ)。
　　[關(guān)鍵詞] 中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng);葛根芩連方;滲透性;離體翻轉(zhuǎn)腸囊;多成分;化學(xué)成分指紋圖譜
　　[收稿日期] 2014-07-18
　　[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473362）;北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011-CXTD-13）
　　[通信作者] *董玲，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事新劑型給藥系統(tǒng)研究，Tel：（010）64286245，E-mail：dongling@bucm.edu.cn;*劉洋，副教授，碩士生導(dǎo)師， 主要從事藥物代謝研究，Tel：（010）84738629，E-mail：liuyang@bucm.edu.cn
　　[作者簡介] 朱美玲，碩士研究生，E-mail：1049613109@qq.com
　　中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的分類依據(jù)中，滲透性是重要指標(biāo)之一，但因中藥成分的復(fù)雜性，尤其是中藥復(fù)方，需按照腸滲透成分歸屬、腸滲透成分定性和腸滲透成分定量分析的過程，逐步闡述。為堅(jiān)持中藥多成分整體性研究的原則，利用化學(xué)成分指紋圖譜技術(shù)，運(yùn)用單味藥材和復(fù)方交叉對比的方法，開展腸滲透多成分的原藥材歸屬研究是可行的。腸滲透性實(shí)驗(yàn)方法很多，通過前期的實(shí)驗(yàn)方法研究，因離體外翻腸囊法的多成分指紋圖譜直觀性最優(yōu)，而被選中。該方法最初是由Wilson和Wiseman于1954年創(chuàng)建[1]，具有直接、快速反映吸收行為，可控、簡便調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)勢，雖定量準(zhǔn)確性稍差，但卻是研究鎖定吸收成分的有效手段。葛根芩連方是源于《傷寒論》的經(jīng)典名方，由葛根、甘草、黃芩和黃連組成。目前對于其藥效成分和質(zhì)量控制具有廣泛而深入的研究報(bào)道[2-3]，但對于其整體的多成分腸滲透性卻未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此本研究對葛根芩連方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探索其組方各味藥材的主要成分在葛根芩連方的多成分環(huán)境下，是否可以被吸收，從而為下一步的多成分腸滲透性定性和定量分析提供基礎(chǔ)支撐。
　　1 材料
　　1.1 儀器
　　Waters液相色譜系統(tǒng)（600四元泵，美國Waters公司）;2487雙波長紫外檢測器，Empower2工作站;電子分析天平（BT-25S，北京賽多利斯儀器有限公司）;超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（DZKW-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。
　　1.2 藥物
　　葛根、黃芩、黃連及甘草購買于北京同仁堂藥店;葛根素對照品（批號110752-200912，中國食品藥品檢定研究院）;葛根素原料（批號120504，陜西中鑫生物技術(shù)有限公司）;黃芩苷原料（批號ZL-A-018，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）;鹽酸小檗堿原料（批號120212，陜西中鑫生物技術(shù)有限公司）;甘草酸單銨原料（批號GU20120611，武漢金諾化工有限公司）。
　　1.3 試劑
　　乙腈購買于美國Fisher公司（色譜級）;乙酸、三乙胺、磷酸、氯化鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、葡萄糖購買于北京化工廠（分析級）;娃哈哈純凈水購買于娃哈哈集團(tuán)公司（中國杭州）。
　　1.4 動(dòng)物
　　Wistar大鼠，雄性，體重200～250 g，北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號 SCXK（京）2012-0001。
　　2 方法
　　2.1 葛根芩連方多成分色譜指紋圖譜分析方法的建立
　　采用高效液相色譜法測定，參照相關(guān)文獻(xiàn)[4]，色譜條件為：Thermo Scientific，Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流速1.0 mL·min-1;檢測波長270 nm;柱溫室溫;進(jìn)樣量10 μL;緩沖溶液（1%三乙胺，1%乙酸，用磷酸調(diào)pH到3.0，A）-甲醇（B）進(jìn)行梯度洗脫（0～12 min，76%A;12～13 min，76%～72%A;13～19 min，72%A;19～20 min，72%～66.2%A;20～37.5 min，66.2%A;37.5～38.5 min，66.2%～59%A;38.5～60 min，59%～25%A）。
　　2.2 葛根芩連方及其組方藥材的離體翻轉(zhuǎn)腸囊法多成分吸收定性研究
　　2.2.1 人工腸液的制備 稱取葡萄糖0.7 g，氯化鎂0.01 g，磷酸二氫鈉0.16 g，氯化鈉3.9 g，氯化鉀0.175 g，氯化鈣0.185 g，碳酸氫鈉0.685 g，用蒸餾水定容于500 mL量瓶中，備用。
　　2.2.2 腸吸收藥液的制備 稱取復(fù)方中的各味藥材研成粉末（全部過20目篩），取適量用50%甲醇超聲提取1 h，時(shí)時(shí)振搖，將提取液濃縮至無甲醇味，加人工腸液制成一定濃度藥液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液供HPLC分析。
　　2.2.3 大鼠離體翻轉(zhuǎn)腸囊模型實(shí)驗(yàn)方法 采用禁食不禁水12 h的健康大鼠，水合氯醛麻醉，小心將腸管同腸系膜剝離，分別取小腸10 cm，放入37 ℃的人工腸液中，沖洗至無內(nèi)容物流出。小心剝離腸段表面的腸系膜和脂肪，將腸管一端結(jié)扎于自制塑料套管，小心將腸管翻轉(zhuǎn)，向腸囊內(nèi)注入1 mL空白人工腸液，結(jié)扎另一端，放入37 ℃恒溫的藥液中，通入氧氣。孵育1 h后將腸囊取出，擦凈表面液體，傾出液體。過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液供HPLC分析。

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