曬黃煙調制期煙葉真菌多樣性研究

　　摘 要：為揭示曬黃煙調制過程中煙葉真菌的多樣性，采用雙平板純培養(yǎng)分離和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析的方法，對調制前期、中期和結束期煙葉樣品中的真菌進行了分離和初步歸類，將代表性菌株進行ITS序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，研究了曬黃煙調制過程中純培養(yǎng)真菌的群落結構組成和動態(tài)變化。結果顯示，從曬黃煙調制期煙葉中共分離獲得126株真菌，下部和上部煙葉分離的菌株數(shù)多于中部煙葉，調制中期分離的菌株數(shù)少于調制前期和調制結束期；這些菌株分布在2門、5綱、10目、14科和17屬；93.65%的菌株屬于Ascomycota門，Epicoccum、Arthrinium和Fusarium為優(yōu)勢屬，分別占23.02%、13.49%和11.90%。研究表明，曬黃煙在調制期間，煙葉真菌類群多樣性比較豐富，在不同煙葉部位的分布有所不同，并隨著調制的進行而發(fā)生動態(tài)變化。
　　關鍵詞：曬黃煙；調制；真菌；多樣性
　　中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2017）06-0012-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.06.002
　　Abstract： To reveal the fungal diversity of yellow sun-cured tobacco during curing， the composition and dynamics of fungal communities were analyzed by a combination of pure cultivation and molecular identification techniques. Cultivable fungi were isolated from the early， middle and late stages of curing. The representative strains were then phylogenetically analyzed based on ITS sequences. The results showed that a total of 126 fungal strains were isolated. The strains isolated from the middle leaves were relatively less compared with those from the bottom and upper leaves. In addition， the tobacco leaves seemed to contain more fungi at the early and late stages comparing to those at the middle stage of curing. The 126 fungal strains were distributed in 2 phyla， 5 classes， 10 orders， 14 families and 17 genera. Ascomycota was the dominant phylum， with 93.65% of the isolates belonging to this phylum， and Epicoccum， Arthrinium and Fusarium were the dominant genera， accounting for 23.02%， 13.49% and 11.90% of the isolates， respectively. It was found that the fungal diversity of yellow sun-cured tobacco leaves during curing was relatively abundant， and the fungal composition varied in different leaf positions and dynamically changed as the curing process proceeded.
　　Keywords： yellow sun-cured tobacco； curing； fungi； diversity
　　成熟的煙葉采收后，大量的微生物，包括細菌、真菌、酵母和放線菌等，仍然存在于煙葉的表面或組織內。在煙葉的調制過程中，這些微生物通過分解煙葉中的糖類和蛋白質等物質來獲取自身生長所需的營養(yǎng)和能量，并將這些大分子物質分解為酚類、醇類、酯類等小分子物質，微生物的代謝活動
　　對煙葉化學成分的組成和煙葉品質的形成都會產生重要的影響[1]。煙葉細菌的多樣性及其對煙葉品質形成的影響研究報道較多[2-7]。真菌是煙葉微生物的另一大類群，數(shù)量僅次于細菌[6]。與細菌相比，目前對煙草真菌種群和結構的研究比較少，主要是采用純培養(yǎng)方法對一些烤煙煙草內生真菌進行了分離鑒定[8-11]。煙草真菌具有有利和有害兩個方面的作用，如防治煙草病蟲害[8]、降低煙堿含量[12-14]、改善煙葉品質[15-17]、引起煙草病害[18]和煙葉腐爛變質等[19-21]。
　　曬黃煙是我國特有的一種煙葉類型，幾百年的栽培和種植使之形成了獨特的煙葉品質，是我國發(fā)展具有獨特香氣風格和口味特征的中式卷煙的優(yōu)質原料。本文采用純培養(yǎng)分離和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析方法，研究曬黃煙煙葉晾曬調制期真菌群落結構的組成和動態(tài)變化，為人工調控并改進曬黃煙煙葉調制方式，提升煙葉品質提供理論指導。
　　1 材料與方法
　　1.1 試驗材料
　　供試樣品取自曬黃煙云曬1號調制過程中的煙葉，該品種種植于云南盈江弄璋曬黃煙基地。
　　1.2 方法
　　1.2.1 煙葉調制和取樣 云曬1號煙葉的調制和取樣方法參照倪紅梅等[7]的方法，2013年3月至4月期間，依次收集下、中和上3個部位的新鮮煙葉（調制第1天）、調制中期煙葉（調制第7天）和調制結束煙葉（調制第13天）。

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