蛋白質相互作用 [藥物分子與蛋白質相互作用研究方法綜述]

　　摘要：本文以近年來藥物與蛋白質的結合研究為基礎，對二者作用的研究方法作了回顧與總結，并簡要對各種方法作一評論。 　　關鍵詞：藥物；蛋白質；研究方法 　　中圖分類號：R977.6 文獻標識碼：A
　　
　　1 前言
　　
　　蛋白質在生物體內(nèi)占特殊地位，它們是構成原生質的主要成分，在各種生命過程中起著重要作用。研究藥物分子與蛋白質的作用，對理解蛋白質結構與功能的關系以及闡明藥物動力學、耐藥性和毒副作用的機理有重要意義。
　　目前，這方面的研究主要集中于藥物分子與血清蛋白和血漿蛋白的作用，其中絕大多數(shù)是與人血清白蛋白（HSA）和牛血清白蛋白（BSA）的作用。白蛋白是主要的血清蛋白，可以和許多內(nèi)源性和外源性化合物結合，通過形成復合物來完成血漿的功能。藥物進入人體后，只有通過血漿的貯存和運輸，才能達到病灶部位，發(fā)揮藥效。隨著科學技術和方法的引入，這方面的研究內(nèi)容也在不斷深入。
　　
　　2 近代研究方法
　　
　　2.1 光譜方法
　　蛋白質分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基都具有特殊的光學活性。許多藥物分子本身也具有光學活性，或與蛋白質分子結合后產(chǎn)生光學活性，因此用光譜方法通過蛋白質分子結合藥物分子后結構的變化研究結合機理，是有效和廣泛的方法。
　　藥物與生物分子相互作用的研究，熒光光譜法是應用廣泛的重要手段，它具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便等優(yōu)點。它能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，這些參數(shù)從各個角度反映了分子的成鍵和結構情況。通過對這些參數(shù)的測定，不但可以定量分析，還可以推斷蛋白質分子在各種環(huán)境下的構象變化。蛋白質分子的內(nèi)源熒光主要是由色氨酸發(fā)出的，根據(jù)Forster能量轉移機理可求出結合蛋白質的藥物分子距蛋白質分子中色氨酸的距離，由此推測藥物與蛋白質結合的空間部位；可直接根據(jù)藥物對其內(nèi)源熒光的猝滅或增強程度來考察相互作用的機理和結合強度，根據(jù)相應公式求得結合常數(shù)及結合位點數(shù)；用藥物分子與結合部位已知的探針來代替（即標記配體）競爭蛋白質結合部位，可確定藥物分子對蛋白質構象的影響。所以，該方法在蛋白質分子構象研究中得到越來越多的應用。近年來，在熒光猝滅法的基礎上，同步熒光法和三維熒光光譜法等新技術也發(fā)揮著重要作用。
　　紫外―可見光譜法也是研究藥物分子與蛋白質相互作用機理最常用、最方便的方法。因為有效藥物與蛋白質分子結合后，它們的吸收光譜會有一定的改變，出現(xiàn)吸收峰位移或譜峰寬度變化，由此可研究蛋白分子與藥物間的結合強弱及結合機理。同時，共振拉曼光譜、紅外光譜等光譜方法也應用于藥物與生物大分子相互作用的研究。
　　在已報道的文獻中，幾種光譜方法常結合使用。如Kamat利用圓二色譜、熒光光譜和紫外光譜法相結合的方法研究了氟喹諾酮藥物對BSA的熒光猝滅機制，用熒光猝滅法測得結合常數(shù)n與表觀結合常數(shù)K，還根據(jù)非輻射能量轉移理論求得BSA與氟喹諾酮藥物之間的結合距離。BSA-氟喹諾酮藥物二元體系的同步熒光光譜、紫外-可見吸收光譜和圓二色譜表明牛血清白蛋白的構象發(fā)生了變化。Tang等分別用共振光生物傳感器、熒光光譜和分子對接模擬技術研究了柔紅霉素與HSA的結合行為。實驗發(fā)現(xiàn)，柔紅霉素使HSA的內(nèi)源熒光猝滅是靜態(tài)過程，而且二者的結合受體系pH的影響。對接模型顯示，結合位點都不處于HSA的經(jīng)典結合位點。進一步分析表明，疏水作用、氫鍵和靜電作用是二者結合的主要推動力。
　　
　　2.2 量熱法
　　生物體新陳代謝的實質就是在有機體內(nèi)的一系列化學反應，在這些過程中，有一部分能量不可避免會以熱效應的形式表現(xiàn)，利用微量熱手段對這些熱效應做精密的測量與詳細的討論，就構成了生物化學熱力學的研究內(nèi)涵。此外，量熱法對被研究體系的溶劑性質、光譜性質以及電化學性質等沒有任何條件的限制，因而有獨到之處。常用的微量熱法有常規(guī)量熱法和差示掃描量熱技術（Differential Scanning Calorimetry， DSC）等，已經(jīng)用于藥物分子與蛋白質的相互研究中。
　　量熱學可根據(jù)不同的結合模型，如位點結合模型、鄰近排斥方程等，確定蛋白質與小分子相互作用的熱力學參數(shù)和結合數(shù)。對于不同小分子與蛋白質的相互作用，它們的各種熱力學參數(shù)和結合數(shù)不同，這種差異在分子識別上是很有用的，可以根據(jù)結合數(shù)和熱力學參數(shù)來判斷蛋白質與小分子的作用機理。
　　分子識別過程是一個很重要的生命過程。目前，國內(nèi)外許多科學家正在致力于探索分子識別過程中的非共價鍵作用力，以便確定結合的特定性和效率。利用X-射線或NMR只能確定它們識別過程中的三維結構，不能得到識別過程中的能量變化。許多蛋白質-配體之間的相互作用表現(xiàn)在熵和熱容方面有很大的變化，可以通過DSC來研究蛋白質-配體之間的相互作用量熱學參數(shù)。利用DSC測定蛋白質-配體之間相互作用的熱力學參數(shù)，可以通過建立模型，測定蛋白質變性前后配體的各種參數(shù)，從而計算得到蛋白質-配體之間相互作用的焓變和熵變及熱容。Barone等人建立了一個熱力學模型，利用DSC變性前后的溫度變化，進一步通過各種數(shù)學變換，得到蛋白質與配體相互作用的焓變與熱容。他們研究了2"CMP和3"CMP與RNAA酶相互作用的量熱曲線，根據(jù)熱力學模型，通過量熱曲線得到它們相互作用的熱力學參數(shù)，并根據(jù)這些參數(shù)討論其識別過程的機理和電解質對這些熱力學性質的影響。他們還進一步利用DSC研究了S-多肽和S-蛋白質、葡萄糖與酵母己糖激酶相互作用的量熱曲線，利用他們所建立的模型進行分析，得到了一些有用的參數(shù)，為蛋白質間相互作用的機理研究提供了一種新的方法。有人利用DSC研究了人血清蛋白與脂肪酸相互作用的量熱曲線，根據(jù)量熱曲線計算得到了熱力學參數(shù)，并根據(jù)這些熱力學參數(shù)對它們的結合機理進行了探討。
　　
　　2.3 核磁共振（NMR）技術
　　NMR是兩種能夠測定生物大分子三維空間結構的技術之一，是研究生物大分子的溶液結構、動力學及分子相互作用的重要工具。特別是在蛋白質的動力學方面，NMR技術具有其他技術無法比擬的優(yōu)越性，可以在接近生物大分子的生理環(huán)境（溫度、鹽濃度、pH值等）下對其溶液進行研究，因而得到的結果更具有說服力。近年來，隨著NMR技術的飛速發(fā)展，對其研究的生物大分子分子量的限制也從10 KDa以下提高到25 KDa，同時，利用這一技術研究生物大分子動力學的方法也有了較大突破。
　　NMR測定蛋白質結構的方法包括四大基本要素：結構測定的主要NMR參數(shù)NOE（nuclear overhauser effect）距離測定；核磁譜峰序列專一性歸屬；NMR結構計算及結構評價；數(shù)據(jù)收集的多維NMR技術。
　　
　　2.4 其它方法
　　電化學方法雖然在一定程度上受到電活性與否的限制，但對于吸收光譜比較弱、電子躍遷譜帶與大分子吸收重疊的組分，無法用吸收光譜法研究的分子，卻能用直接伏安法進行研究。此外，平衡滲析、粘度測定以及離心超過濾、高效液相色譜、微滲析、質譜、毛細管電泳等方法也應用于藥物與蛋白質分子相互作用的研究。
　　
　　參考文獻
　　[1]ChongQiu Jiang， MingXia Gao， XianZhe Meng. Study of the interaction between daunorubicin and human serum albumin， and the determination of daunorubicin in blood serum samples[J]. Spectrochimica Acta Part A， 2003， 59（7）.
　　[2]秦身鈞， 申金山， 李艷廷，等. 稀土金屬離子及pH誘導牛血清白蛋白構象變化的同步熒光光譜研究[J]. 中國稀土學報， 2004， 22（3）.
　　[3]顏承農(nóng)， 張華新， 鞠香，等.熒光光譜法研究鈣試劑羧酸鈉與牛血清白蛋白結合反應特征[J]. 分析化學， 2005， 33（6）.
　　[4]B. Abraham， C. V. Sastri， B. G. Maiya， S. Umapathy. Resonance Raman spectroscopic studies of [Ru （phen）2qdppz]2+ and its interactions with calf thymus DNA[J]. Journal of Raman Spectroscopy， 2004， 35（1）.
　　[5]Sh. Nafisi， A. Hajiakhoondi， A. Yektadoost. Thymol and carvacrol binding to DNA： model for drug-DNA interaction[J]. Biopolymers， 2004， 74（5）.
　　[6]Bhalchandra P. Kamat， Study of the interaction between fluoroquinolones and bovine serum albumin[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2005， 39（5）.
　　[7]Kai Tang， Yi-Min Qin， Ai-Hua Lin， et al. Interaction of daunomycin antibiotic with human serum albumin： Investigation by resonant mirror biosensor technique， fluorescence spectroscopy and molecular modeling methods[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2005， 39（3-4）.
　　[8]Ming Guo， WeiJun Lu， Ping-Gui Yi， et al. Study on the thermodynamic characteristics between fluoroquinolone and bovine serum albumin[J]. The Journal of Chemical Thermodynamics， 2007， 39（3）.
　　[9]G. Barone， P. Catanzano， P. Del Vecchio， et al. Differential scanning calorimetry as a tool to study protein-ligand interactions[J]. International Union of Pure and Applied Chemistry， 1995， 67（11） .
　　[10]Sara B.-M. Whittaker， Graham R. Spence， J. Günter rossmann， et al. NMR analysis of the conformational properties of the trapped on-pathway folding intermediate of the bacterial immunity protein Im7[J]. Journal of Molecular Biology， 2007， 366（3）.
　　[11]Chu Kong Liew， Merlin Crossley， Joel P. Mackay， et al. Solution structure of the THAP domain from caenorhabditis elegans C-terminal binding protein （CtBP）[J].Journal of Molecular Biology， 2007， 366（2）.
　　[12]Alexander L. Watters， Pritilekha Deka， Colin Corrent， et al. The highly Cooperative folding of small naturally occurring proteins is likely the result of natural selection[J]. Cell， 2007， 128（3）.
　　[13]敬登偉， 張劍， 張高勇. DNA與非離子糖基表面活性劑相互作[J]. 化學學報， 2004， 62（6）.
　　[14]Shuyun Bi， Chunyu Qiao， Daqian Song， et al. Study of interactions of flavonoids with DNA using acridine orange as a fluorescence probe[J]. Sensors and Actuators B： Chemical， 2006， 119（1）.
　　[15]Hare L.G.， Millership J.S.， Collier P.S.， et al. The use of polymeric solid phase extraction and HPLC analysis for the determination of ranitidine in routine plasma samples obtained from paediatric patients[J]. Journal of Pharmcy and Pharmacology， 2001， 53（9）.
　　[16]Hua Chen， Zhengjun Gong， Zhujun Zhang. Coupling microdialysis with flow-injection chemiluminescence detection for a protein-drug interaction study[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2006， 41（4）.
　　[17]Hak-Joon Seok， Mi-Young Hong， Young-Ja Kim， et al. Mass spectrometric analysis of affinity-captured proteins on a dendrimer-based immunosensing surface： investigation of on-chip proteolytic digestion[J]. Analytical Biochemistry， 2005， 337（2）.

相關熱詞搜索：相互作用 蛋白質 綜述 藥物分子與蛋白質相互作用研究方法綜述 相互作用方法綜述 分子相互作用檢測方法對比