條件培養(yǎng)基對氧—葡萄糖剝奪誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元死亡的保護作用

　　【摘要】 目的 研究臍帶間充質(zhì)干細胞源條件培養(yǎng)基（CM）對氧-葡萄糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元死亡的保護作用。方法 培養(yǎng) 10 d的皮層神經(jīng)元更換培養(yǎng)基為 EBSS平衡鹽溶液， 后置于37℃低氧（N2∶CO2∶O2=94%∶5%∶1%）培養(yǎng)箱內(nèi)孵育， 4 h后恢復(fù)正常條件培養(yǎng)， 同時更換為條件培養(yǎng)基作用20 h，
　　用Hoechst33342 / PI 的染色方法檢測其死亡情況。結(jié)果 原代培養(yǎng)的 UCMSCs 傳至第三代時， 細胞形態(tài)為長梭形的纖維狀， 折光性好;在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元建立OGD模型， Control組細胞死亡率為（5.85%±0.41）%， OGD組細胞死亡率（35.6%±1.75）%， Control組與OGD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）， OGD模型建立成功;復(fù)氧0 h時給予臍帶間充質(zhì)干細胞源條件培養(yǎng)基， 作用24 h后， OGD+CM組細胞死亡率為（27.98±2.19）%， OGD+CM組與OGD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， CM可使皮層神經(jīng)元的死亡率降低21.40%。結(jié)論 臍帶間充質(zhì)干細胞源條件培養(yǎng)基對氧-葡萄糖剝奪誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元具有保護作用。
　　【關(guān)鍵詞】 氧-葡萄糖剝奪模型;間充質(zhì)干細胞;條件培養(yǎng)基;皮層神經(jīng)元
　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.12.120
　　缺血性腦卒中是因各種原因?qū)е麓竽X供血不足， 從而引起腦組織壞死的總稱， 具有發(fā)病率高、致死率高和致殘率高的特點。氧-葡萄糖剝奪（Oxygen-Glucose Deprivation， OGD）模型是最常用的缺血性腦卒中的體外模型， 能夠在體外很好的模擬腦卒中的病理狀態(tài)。
　　臍帶間充質(zhì)干細胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， UCMSCs）來源于中胚層間充質(zhì)的成體干細胞， 具有易于獲取， 無倫理學(xué)爭議， 增殖能力較強， 易于體內(nèi)外擴增等特性， 成為臨床干細胞移植的重點關(guān)注對象， 然而無論通過何種途徑輸入體內(nèi)， 到達靶器官的細胞數(shù)量、狀態(tài)及存活時間尚無足夠的研究證實， 而間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)其可通過旁分泌途徑分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、 成纖維細胞生長因子（Basic Fibroblast Growth Factor， bFGF）等大量生物活性物質(zhì)[1， 2]， 近年亦有研究報道間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell， MSCs）衍生的胞外囊泡可參與細胞間傳遞、細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)以及在體內(nèi)短距離或長距離運輸以改變細胞或組織的代謝[3]， 因此， 嘗試使用臍帶間充質(zhì)干細胞來源的條件培養(yǎng)基（Condition Medium， CM）進行研究， 觀察其保護神經(jīng)元的作用。
　　目前應(yīng)用細胞模型研究條件培養(yǎng)基保護OGD中神經(jīng)元死亡的相關(guān)研究較少， 本實驗制備臍帶間充質(zhì)干細胞來源條件培養(yǎng)基， 其中含有臍帶間充質(zhì)干細胞分泌的大量細胞因子成份， 在體外細胞培養(yǎng)模型中研究其對神經(jīng)元的保護作用， 從而為缺血性腦血管病的臨床治療提供新的思路和實驗依據(jù)�，F(xiàn)報告如下。
　　1 材料與方法
　　1. 1 臍帶間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)與條件培養(yǎng)基的獲取
　　UCMSCs的原代分離培養(yǎng)：將無菌條件下獲取的臍帶組織用無菌磷酸緩沖液（PBS）沖洗多次， 至無血跡殘留;仔細剔除臍帶內(nèi)血管與表面組織;將組織剪碎， 加入Ⅳ型膠原酶，
　　37℃消化17～20 h， 期間不時搖晃;再用40 ?m篩網(wǎng)過濾， 去除較大組織塊;2000 r/min， 離心5 min， 棄去上清， 將沉淀用無菌PBS清洗2～3次;1000 r/min， 離心5 min， 接種。用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸離心管中的細胞， 鏡下細胞計數(shù)， 使細胞密度達到1×106個/ml， CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 換液， 將臍帶間充質(zhì)干細胞不斷傳代、純化， 得到UCMSCs。
　　UCMSC-CM的收集：純化后的UCMSCs， 收集每次換液的培養(yǎng)基， 經(jīng)1500 r/min離心去除細胞碎片后， 放置在-80℃冰箱保存。
　　1. 2 Elisa檢測條件培養(yǎng)基中細胞因子 向96孔板加入100 μl 1×稀釋液， 作為陰性對照。同時加入所測因子的標準品100 μl到96孔板， 然后將所測樣品100 μl加到96孔板， 每個樣品2個微孔， 室溫下避光孵育2 h。孵育結(jié)束后向每個微孔加入200 μl酶標檢測抗體， 室溫下孵育2 h。然后用400 μl l×沖洗液洗滌， 最后加入200 μl顯色底物（顯色劑A和顯色劑B各100 μl）， 室溫下孵育30 min， 然后加入50 μl終止液， 用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值）， 通過標準曲線計算樣品中生長因子的含量。計算神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、胰島素樣生長因子-I（IGF-1）、VEGF、bFGF、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、肝細胞生長因子（HGF）、白細胞介素-6（IL-6）的濃度。每個樣品重復(fù)4次， 每組取3個樣品。
　　1. 3 OGD的構(gòu)建 取培養(yǎng)至10 d的皮層神經(jīng)元， 用無糖EBSS漂洗 1 次， 將細胞培養(yǎng)基置換為無糖EBSS， 原培養(yǎng)液留至復(fù)氧后繼續(xù)使用。于缺氧孵箱（ 94% N2， 1% O2， 5% CO2， 37℃）缺氧 4 h后更換為正常培養(yǎng)基復(fù)氧， 繼續(xù)培養(yǎng)20 h進行檢測。
　　1. 4 皮層神經(jīng)元死亡的檢測 向OGD成功后的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)液內(nèi)直接加入 Hoechst33342（sigma， 10 μg/ml）， 37℃作用 10 min， 再加入PI（sigma， 5 μg/ml） 37℃作用5 min ， 在熒光顯微鏡下觀察細胞死亡情況并拍照計數(shù)。Hoechst33342 標記活細胞及凋亡早期的細胞， PI標記的為壞死細胞及凋亡晚期細胞， 細胞死亡率= PI 陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

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