N—乙酰—5—羥色胺對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護作用

　　【中圖分類號】R285.5 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）03-0-01
　　視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科臨床常見的病理生理過程，嚴重影響患者的視覺功能[1]。缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚未明確，有研究證實視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷與細胞凋亡有密切的關系[2，3]。N-乙酰-5-羥色胺（N-acetylserotonin，NAS）是一種自由基清除劑，對肝細胞、腦細胞的氧化損傷具有保護作用[4]。有研究證實NAS可增加肝微粒體膜的穩(wěn)定性，課題組前期研究證實NAS可減輕肝缺血再灌注損傷小鼠肝臟結構的損傷，抑制肝細胞凋亡，改善肝臟功能[5，6]。但是近年來有關NAS對視網(wǎng)膜缺血再灌注的保護作用報道較少。本研究擬通過觀察NAS對視網(wǎng)膜細胞缺血再灌注損傷的保護作用，為開發(fā)治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的新藥、提高視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的療效提供實驗依據(jù)。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 實驗動物及分組 健康成年SD大鼠30只，體重300g左右，隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組（10只）、缺血再灌注組（10只）以及NAS組（10只），正常對照組不加干預，缺血再灌注組于造模前30min腹腔注射5mg/kg的生理鹽水，NAS組于造模前30min腹腔注射5mg/kg的NAS。
　　1.1.2 主要試劑 NAS（Sigma公司，美國）；HE染色試劑盒（碧云天生物技術有限公司，海門）；兔抗大鼠Bcl-2、兔抗大鼠Bax（Abcam公司，美國），免疫組化試劑盒（博奧森公司，北京）、DAB顯色劑（中杉金橋生物技術有限公司，北京）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 RIRI模型制作 按照文獻報道，采用右眼生理鹽水前房加壓灌注法制作視網(wǎng)膜缺血再灌注模型[7]。
　　1.2.2 組織切片制作 各組大鼠于RIRI 72 h后取眼球組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，將包埋好的標本平行于視神經(jīng)矢狀軸進行切片，切片厚約4μm。
　　1.2.3 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，蘇木素液染色，雙蒸水沖洗，1%鹽酸酒精分化，雙蒸水沖洗，梯度酒精脫水，伊紅染色，95%鹽酸酒精分色，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。
　　1.2.4 免疫組織化學染色 90?C烤片2h，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽抗原修復，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，加入兔抗大鼠Bcl-2（1：500）和兔抗大鼠Bax（1：500）一抗并4?C孵育過夜，PBS緩沖液沖洗，加入二抗，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察結果。
　　1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 10.0軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　2 結果
　　2.1 HE染色結果 正常對照組大鼠視網(wǎng)膜結構清晰，各層細胞排列緊密；缺血再灌注組大鼠視網(wǎng)膜各層高度水腫，神經(jīng)節(jié)細胞逐漸減少且分布紊亂；NAS組較缺血再灌注組細胞水腫明顯減輕，細胞排列趨于規(guī)整，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少程度有顯著緩解。
　　2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達的變化 正常對照組視網(wǎng)膜可見大量Bcl-2陽性細胞，細胞數(shù)為1580±23.75個·mm-2；缺血再灌注損傷組Bcl-2陽性細胞顯著下降，細胞數(shù)為845±17.89個·mm-2；NAS組Bcl-2陽性細胞數(shù)為1258±18.45個·mm-2，顯著多于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜Bax蛋白表達的變化 正常對照組大鼠視網(wǎng)膜Bax陽性細胞較少，細胞數(shù)為98.75±15.98個·mm-2；缺血再灌注組Bax陽性細胞數(shù)為869.78±18.97個·mm-2；NAS組Bax陽性細胞顯著少于缺血再灌注組，為125.85±28.49個·mm-2，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3 討論
　　N-乙酰-5-羥色胺（N-acetylserotonin，NAS）是一種自由基清除劑，對肝細胞、腦細胞等氧化損傷均具有保護作用[8]。SHAHAR等建立大鼠腸缺血再灌注損傷模型，觀察NAS對缺血再灌注后腸道細胞的保護作用，證實NAS可以抑制大鼠腸缺血再灌注損傷后細胞凋亡，有效預防腸黏膜損傷[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NAS可減輕肝缺血再灌注損傷小鼠肝臟結構的損傷，改善肝臟功能，抑制肝細胞的凋亡[4]。本實驗將NAS用于大鼠RIRI模型中，通過觀察大鼠視網(wǎng)膜結構的變化以及Bcl-2蛋白和Bax蛋白的改變，研究NAS對大鼠RIRI后視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的保護作用。
　　HE染色結果證實正常對照組大鼠視網(wǎng)膜結構清晰，各層細胞排列緊密；缺血再灌注組大鼠視網(wǎng)膜各層高度水腫，神經(jīng)節(jié)細胞逐漸減少且分布紊亂；NAS組較缺血再灌注組細胞水腫明顯減輕，細胞排列規(guī)整，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少程度有顯著緩解。Bcl-2家族成員在凋亡過程中起著關鍵作用。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，可阻斷細胞色素C的釋放，抑制下游凋亡反應，而Bax是促凋亡蛋白，通過與Bcl-2而封閉其活性，同時促進細胞色素C的釋放促進細胞凋亡的發(fā)生[10，11]。本研究證實NAS組RIRI后Bcl-2陽性細胞顯著多于缺血再灌注組，提示經(jīng)NAS干預后Bcl-2蛋白表達上調。缺血再灌注損傷組RIRI后神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層可見Bax陽性細胞，NAS組Bax陽性細胞顯著少于缺血再灌注損傷組，證實在NAS的作用下Bax蛋白表達降低。提示NAS抑制RIRI大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡的機制可能與促進Bcl-2蛋白表達并抑制Bax蛋白表達有關。
　　總之，NAS可促進RIRI后大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，從而減輕細胞凋亡，具有一定的神經(jīng)保護作用，為臨床治療RIRI提供了新思路和研究方法。

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