單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌液相芯片檢測(cè)方法的建立

　　摘 要：目的是建立一種快速檢測(cè)單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌的液相芯片檢測(cè)方法。采用基于間接競(jìng)爭(zhēng)法的原理，將3種細(xì)菌抗原分別與不同的聚苯乙烯微球偶聯(lián)，以藻紅蛋白（PE）熒光標(biāo)記二抗為信號(hào)，優(yōu)化反應(yīng)條件，對(duì)建立的方法進(jìn)行靈敏度、特異性和可重復(fù)性驗(yàn)證。結(jié)果顯示，3種細(xì)菌檢測(cè)抗體最佳加入量分別為10ng、10ng、5ng，建立的方法檢測(cè)單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限均可達(dá)到103 CFU/mL，檢測(cè)其他常見(jiàn)食源性致病菌無(wú)交叉反應(yīng)。結(jié)論表明，建立了一種快速檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的液相芯片檢測(cè)方法，能夠應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
　　關(guān)鍵詞：?jiǎn)卧隼钏固鼐?副溶血弧菌 沙門(mén)氏菌 液相芯片 檢測(cè)
　　前言
　　近年來(lái)，食源性疾病已成為世界上最突出、最廣泛的食品安全問(wèn)題，病原微生物引起的食源性疾病則是影響食品安全的最主要因素之一[ 1 ]。微生物性食物中毒事件主要由食物污染或變質(zhì)、生熟交叉污染等原因引起，且氣溫較高、氣候潮濕的環(huán)境適于細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致食物易于腐敗變質(zhì)，一旦儲(chǔ)存、加工不當(dāng)，極易發(fā)生由沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌等微生物引起的食物中毒�，F(xiàn)行檢測(cè)手段已無(wú)法滿足日常對(duì)食源性致病菌檢測(cè)的需要，目前檢驗(yàn)檢疫工作中常用于檢測(cè)和鑒定食源性致病菌的方法主要有PCR、Southem Blot雜交、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等一些簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法[ 2 ]�，F(xiàn)行的檢測(cè)方法一般以檢測(cè)致病菌為主，需要增菌培養(yǎng)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法滿足高通量的檢測(cè)要求，遠(yuǎn)不能滿足食品檢測(cè)的需要，市場(chǎng)迫切需要能同時(shí)檢測(cè)食源性致病菌的靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、簡(jiǎn)便快捷的高通量技術(shù)和方法[ 3 ]。因此，目前迫切需要發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確的方法來(lái)檢測(cè)和追蹤病原體和污染物的來(lái)源[4]。
　　液相芯片技術(shù)是在流式細(xì)胞技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和傳統(tǒng)芯片技術(shù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的新一代生物芯片技術(shù)和新型蛋白質(zhì)研究平臺(tái)，能同時(shí)檢測(cè)多種致病菌。邱楊等[ 5 ]通過(guò)該法建立了對(duì)沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度達(dá)到50～100copies/mL。郭啟新等[ 6 ]建立了對(duì)金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、志賀氏菌的檢測(cè)方法，具有很好的特異性，檢測(cè)靈敏度分別達(dá)38、44、21CFU/mL。Sun等[ 7 ]利用該法建立了高通量的同時(shí)檢測(cè)6種食源性致病菌的方法，檢測(cè)靈敏度達(dá)到20.4×103CFU/mL，遠(yuǎn)高于PCR。
　　但基于多重PCR的液相芯片技術(shù)對(duì)單管樣本進(jìn)行大量不同指標(biāo)的高通量多重PCR方法建立仍存在困難，至今鮮見(jiàn)液相芯片用于檢測(cè)多種致病菌方法建立的相關(guān)報(bào)道。將液相芯片技術(shù)應(yīng)用到食源性致病菌檢測(cè)中，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行多種致病菌靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)，因而有望大大提高食源性致病菌的檢測(cè)效率，在有效控制食物中毒事件的發(fā)生、食品安全控制、海關(guān)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、臨床診斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　Luminex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)（美國(guó)Luminex公司）；4625型孔板振蕩器；ST16R冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；編號(hào)No.18、No.29、No.52的微球（美國(guó)Luminex公司）�；罨�緩沖液：0.1mol/L NaH2P04- N a2 HP04，pH6.2；磷酸鹽緩沖液（PBS）：138mmol/L NaCI，2.7mmol/L KCl，8mmol/ L Na2HP04，1.5mmol/L KH2P04，pH7.4；洗滌緩沖液：PBS，0.05%Tween-20，pH7.4；分析緩沖液：PBS，1%BSA，pH7.4；封閉緩沖液：50mmol/L Tris，153mmol/L NaCl，2%BSA，0.05%Tween-20，pH7.4；儲(chǔ)存緩沖液：PBS，0.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%疊氮化鈉，pH7.4。菌種為本實(shí)驗(yàn)室保藏與西北農(nóng)林科技大學(xué)食品實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。
　　1.2 方法
　　1.2.1 微球偶聯(lián)抗原
　�、偃∥⑶�50μL（1.25×106個(gè)/mL）置于EP管，14000g離心4min，棄上清液。
　�、诩尤�40μL活化緩沖液重懸微球，漩渦混合30s。
　　③加入50mg/mL NHS和EDC各5μL，混勻，避光室溫下旋轉(zhuǎn)混合600rpm，20min。
　�、芗尤�150μL PBS，漩渦混合10s，14000g離心4min，棄上清液。
　�、萦肞BS洗滌3次后，加入150μL PBS重懸，再加入抗原，用PBS補(bǔ)齊至500μL，避光室溫旋轉(zhuǎn)混合600rpm，2h。
　　⑥14000g離心4min，棄上清液。
　�、呒尤�150μL封閉緩沖液，漩渦混合15s，避光室溫旋轉(zhuǎn)混合600rpm，30min。
　　⑧16000g離心4min，棄上清液，加入100μL儲(chǔ)存緩沖液4℃保存偶聯(lián)的微球。抗原加入量為50ng。1.2.2 檢測(cè)
　�、偃〕雠悸�(lián)微球，恢復(fù)至室溫后漩渦30s。
　�、�96孔板中加入100μL PBS預(yù)濕實(shí)驗(yàn)孔，抽去孔內(nèi)液體，每孔中加入適量預(yù)混好的偶聯(lián)微球（約2000個(gè)），用150μL PBS洗滌兩次。
　　③將適量標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加入合適的孔中，空白孔加入等量PBS，再加入適量的抗體，用PBS補(bǔ)齊各孔至100μL。
　�、苡靡埔浩鞣磸�(fù)抽吸混勻孔內(nèi)溶液，避光條件下37℃，600rpm振蕩60min。
　�、莘磻�(yīng)完畢后，抽去孔內(nèi)液體，用150μL PBS洗滌兩次。
　�、廾靠字屑尤�100μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的PE標(biāo)記二抗，移液器反復(fù)抽吸混勻。
　�、弑芄鈼l件下，37℃，600rpm振蕩45min后，抽去孔內(nèi)液體，用150μL PBS洗滌兩次。

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