微紫青霉果膠酶降解再造煙葉高濃混合漿中果膠的研究

　　摘要：為降低再造煙葉中的果膠含量，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)微紫青霉產(chǎn)果膠酶降解果膠的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，分析了酶解前后樣品的熱裂解產(chǎn)物，并將酶解后樣品抄造制絲添加至卷煙中進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：微紫青霉產(chǎn)果膠酶降解果膠的最佳反應(yīng)條件為酶活力3000 U/mL，高濃混合漿干重與粗酶液體積的料液比1GA6FA1，反應(yīng)溫度50 ℃，處理時(shí)間3 h.在此條件下果膠降解率達(dá)到最大，為28.63%，相對(duì)分子量由341 kDa減小到55 kDa.酶解后樣品裂解產(chǎn)物的組成和含量發(fā)生明顯變化，除醇類物質(zhì)外，其他香味物質(zhì)酚類、醛酮類、酯類、雜環(huán)類減少.將酶解后的樣品抄造制絲添加于卷煙中，香氣質(zhì)豐滿細(xì)膩，透發(fā)性、甜潤(rùn)感增強(qiáng)，刺激性減小，余味純凈舒適，吸食品質(zhì)得以改善，但勁頭略有不足.
　　關(guān)鍵詞：微紫青霉;果膠酶;再造煙葉;果膠降解率
　　中圖分類號(hào)：TS41文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.004
　　文章編號(hào)：2096-1553（2019）01-0027-09
　　0 引言
　　果膠是構(gòu)成煙草細(xì)胞壁的主要物質(zhì)之一，在煙草中的含量約占5%～13%（若無特指，百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），它是以半乳糖醛酸為主鏈，并連接著2-吡喃型鼠李糖基的復(fù)合多糖類物質(zhì)[1-3].這類物質(zhì)在熱解時(shí)會(huì)產(chǎn)生甲醇，并進(jìn)一步氧化為甲醛、甲酸等，這些氧化產(chǎn)物會(huì)增加煙草燃吸時(shí)的刺激性，對(duì)煙草的內(nèi)在品質(zhì)和安全性產(chǎn)生不利影響[4-6]，對(duì)人體有害.因此，適當(dāng)降低煙葉中果膠的含量，對(duì)于提升煙葉品質(zhì)、降低卷煙危害，具有重要的意義.
　　煙草果膠降解通常采用生物酶解方法.施林燕[7]通過對(duì)煙梗絲施加復(fù)合酶，使煙梗絲中的果膠含量降低13.08%.于建軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)煙葉施加果膠酶后會(huì)使煙草香氣物質(zhì)含量增加29.94%，可能是由于施加果膠酶后使煙葉中總糖含量增加所致.于興偉等[9]采用固態(tài)發(fā)酵法用黑曲霉處理煙梗，發(fā)現(xiàn)煙草中果膠含量也明顯降低.馬東萍等[10]選用復(fù)合中性纖維素酶、酸性蛋白酶、復(fù)合果膠酶和中性脂肪酶配制成一種改性添加劑，這種改性添加劑可對(duì)煙梗中果膠、蛋白質(zhì)等大分子化合物進(jìn)行有效的生物降解和轉(zhuǎn)化，從而改善萃取液中的致香物質(zhì).柏婷[11]利用生物酶解技術(shù)和化學(xué)技術(shù)對(duì)果膠進(jìn)行降解.結(jié)果表明，當(dāng)果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，煙草中果膠含量由18.61%降低至 9.52%，且再造煙葉煙香較濃，刺激性明顯下降，感官品質(zhì)也得到明顯改善.然而，利用微紫青霉生產(chǎn)果膠酶并將其應(yīng)用于煙草果膠降解的報(bào)道則相對(duì)較少[12-14].鑒于此，本研究擬采用從煙田土壤中分離出的微紫青霉（Penicillium janthinellum）sw09菌株，根據(jù)該菌株高產(chǎn)果膠酶的特性，利用其粗酶液對(duì)造紙法再造煙葉混合漿料進(jìn)行果膠降解處理，并進(jìn)一步開展化學(xué)分析和感官質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為煙葉品質(zhì)提升和卷煙危害成分降低研究提供參考和借鑒.
　　1 材料與方法
　　1.1 材料、試劑與儀器
　　供試材料：配方煙絲，河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供;高濃混合漿，取自河南煙草工業(yè)薄片有限公司工藝生產(chǎn)線;果膠酶為由鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室篩選的微紫青霉sw09產(chǎn)出的粗果膠酶液，即發(fā)酵上清液.
　　試劑：3，5-二硝基水楊酸（DNS），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn);果膠標(biāo)準(zhǔn)品（酯化度67%～70%），Sigma＼|Aldrich公司產(chǎn);D-（+）-半乳糖醛酸一水化合物標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%）和0.15%的咔唑溶液，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn).
　　儀器：ATY124型電子分析天平，日本島津公司產(chǎn);Ultra3400型紫外分光光度計(jì)，北京普源精電科技有限公司產(chǎn);HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn);Agilent6890/5973型氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn);CDSPYROPROBE2000裂解儀，上海光譜儀器有限公司產(chǎn).
　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法
　　1.2.1 微紫青霉產(chǎn)果膠酶粗酶液的獲取
　　將活化后的微紫青霉sw09接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度分別為葡萄糖50 g/L，酵母浸粉3 g/L，KH2PO4 1 g/L，果膠2 g/L，pH=5）[15].發(fā)酵條件為：5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，攪拌速度150 r/min，通氣量2 V/（V·min），發(fā)酵溫度32 ℃，初始pH=5，發(fā)酵時(shí)間72 h.待發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心取上清液，即為果膠酶粗酶液[16].
　　1.2.2 微紫青霉產(chǎn)果膠酶粗酶液降解混合漿中果膠單因素試驗(yàn)
　　酶活的定義為：在45 ℃，pH=5條件下，1.0 mL酶液每min分解果膠產(chǎn)生1.0 μg 的D-半乳糖醛酸，即為一個(gè)酶活單位（1 U/mL）.通過單因素試驗(yàn)研究不同酶活力、酶解時(shí)間和反應(yīng)溫度條件下，微紫青霉產(chǎn)果膠酶粗酶液對(duì)混合漿中果膠含量的降解情況.
　　1.2.2.1 不同酶活力的粗酶液降解果膠能力的試驗(yàn)[17]
　　將不同酶活力的粗酶液（14 000 U/mL，6000 U/mL，3000 U/mL，1000 U/mL，700 U/mL 和450 U/mL），以料液比（m（混合漿干重/g）GA6FAV（粗酶液體積/mL），下同）為1GA6FA3的比例均勻噴施于10 g混合漿上，在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解結(jié)束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測(cè)定各處理組樣品果膠含量，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.
　　1.2.2.2 不同酶解時(shí)間下粗酶液降解果膠能力的試驗(yàn)
　　將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液，以料液比1GA6FA3，均勻噴施于10 g混合漿上，在50 ℃下分別酶解0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h和3.0 h.待酶解結(jié)束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測(cè)定各處理組樣品果膠含量，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

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