HPLC—ELSD法同時測定蔥子藥材三個皂苷類成分

　　[摘要]　目的：為蔥子藥材質(zhì)量控制提供一種多成分同時在線檢測的分析方法。方法：應(yīng)用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法(IIPLC—ELSD)同時測定蔥子藥材中三個皂苷的含量。結(jié)果：皂苷A、B、c分別在73.4～1175.00μg/mL(r=0.9996)、96.25～1540.00μg/mL(r=0.9991)、110.00～1760.00μg/mL(r=0.9991)濃圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率分別為99.53％，99.08％，99.17％。結(jié)論：該方法分析時間短、專屬性好、準(zhǔn)確度高，可用于綜合評價蔥子藥材的質(zhì)量。
　　[關(guān)鍵詞]　蔥子藥材；高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法；皂苷
　　[中圖分類號]R286.0　[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A　[文章編號]1007—8517(2011)15—0039—02
　　
　　蔥子Semen Allii Fistulosi為百合科蔥屬植物蔥Alliumfistulasum的干燥成熟種子。其性溫，味辛，具有補(bǔ)中益精，明目散風(fēng)的功效，用于。腎虛，目眩，風(fēng)寒感冒等癥。研究表明，蔥中含有黃酮，甾體皂苷，生物堿，硫化物，脂肪酸等成分，主要用于抗菌及抗真菌，抗腫瘤，抗血小板聚集，抗氧化等。近幾年備受關(guān)注的是其心血管活性，據(jù)報道，大蔥提取物有抑制血小板的凝集，抗凝血素釋放，調(diào)整血管緊張度以及降血壓等作用。蔥子藥材資源豐富，廣泛分布于全國大部分地區(qū)，受各地環(huán)境、土壤、氣候等因素的影響，藥材品質(zhì)必定存在優(yōu)劣差異。為了完善蔥子藥材活性成分的質(zhì)量評價體系，本文在系統(tǒng)的化學(xué)成分研究和藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上，建立高效液相色譜一蒸發(fā)光散射法(HPLC—ELSD)測定了蔥子三個主要皂苷的含量方法，為蔥子藥材的質(zhì)量評價提供一種合理的方法。
　　
　　1、儀器與試藥
　　
　　Waters2695高效液相色譜儀(美國，Waters公司)，包括四元泵，2998PAD二極管陣列檢測器串聯(lián)2420ELSD蒸發(fā)光散射檢測器，自動進(jìn)樣器，Waters Empower 3工作站；KQ一500E臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SartoriusBP211D型十萬分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；乙腈為色譜純(德國MERCK公司)，水為娃哈哈高純水，其余試劑均為分析純。
　　對照品蔥子皂苷A、蔥子皂苷B、蔥子皂苷c均自制，用HPLC峰面積歸一化法測定，純度達(dá)98％。蔥子藥材由本人鑒定確認(rèn)。
　　
　　2、方法與結(jié)果
　　
　　2.1　色譜條件
　　Waters Symmetry C18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；流動相為0.05％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫：0～3min，5％～22％B；3～16min，22％～23％B；16～30min，23％～27％B；；流速1.0mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。ELSD檢測器參數(shù)：漂移管溫度為40℃；載氣壓力為3.5Bar。對照品及樣品色譜圖見下圖。在此色譜條件下，3個目標(biāo)成分能夠很好地分離，峰形尖銳，無明顯的雜質(zhì)峰影響。
　　
　　2.2　供對照品溶液的配制，上述3個成分的對照品減壓干燥48小時取適量，精密稱定，用乙腈溶解，分別配制成1.0mg/mL貯備母液；精密量取各成分母澉適量，按比例配成含3個成分的混標(biāo)溶液，保存于4℃冰箱中，備用。
　　2.3　試品溶液的配制取蔥子藥材粉末5.0g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，稱重。加入10mL純水，浸泡過夜，超聲處理30min，過濾，殘渣再以10mL純水超聲處理30min，過濾，合并提取液，置100mL燒瓶中。減壓濃縮，濃縮液置1mL容量瓶中，30％乙腈-水溶液定容至1mL，混勻，0.45μm微孔濾膜過濾，既得。
　　2.4　標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍，上述混標(biāo)溶液用30％乙腈依次稀釋成系列濃度，搖勻，進(jìn)樣分析。每個濃度進(jìn)樣3次，取平均值。以濃度的常用對數(shù)LgC為橫坐標(biāo)(x)，以峰面積的常用對數(shù)LgA為縱坐標(biāo)(Y)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。皂苷A線性方程：Y=1.5416x-0.5731(r=0.9996)表明蔥子皂苷A在73.4和1175.00μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。皂苷B線性方程：Y=1.3618x-0.4576(r=0.9991)表明蔥子皂苷B在96.25-1540.00μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。皂苷C線性方程：Y=1.2993x-0.4147(r=0.9991)表明蔥子皂苷C在110.00-1760.00μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
　　2.5　精密度試驗精密吸取同一供試品溶液，一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣分析，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)三天進(jìn)樣分析，計算日間精密度。結(jié)果表明，各成分色譜峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，日間精密度和日內(nèi)精密度數(shù)據(jù)(RSD％)在1.20％～1.82％之間，說明儀器的精密度良好。
　　2.6　重復(fù)性試驗取6份蔥子藥材粉末各約5.0g(產(chǎn)地：四川自貢)，精密稱定，分別按上述方法制備樣品溶液，測定三種有效成分的含量，計算其RSD％，進(jìn)行重復(fù)性考察。結(jié)果表明，三個皂苷的峰面積的RSD％分別為0.80％，1.18％和1.23％，說明本測定方法的重復(fù)性良好。
　　2.7　樣品溶液穩(wěn)定性試驗取一份制備的供試品溶液，在儀器不關(guān)閉的狀態(tài)下，分別在0，1，2，4，8，12，16小時進(jìn)樣檢測，觀察其峰面積的變化。結(jié)果表明，三個種目標(biāo)化合物的峰面積沒有明顯變化，表明樣品溶液基本穩(wěn)定，峰面積RSD均在3％以內(nèi)。結(jié)果表明，樣品在16h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。
　　2.8　加樣回收率實驗取蔥子藥材粉術(shù)(產(chǎn)地：I四)U自貢)5.0g，精密稱定，分別精密加入適量的對照品溶液，測定四種有效成分的含量，計算其RSD％，進(jìn)行加樣回收率考察，結(jié)果三個皂苷成分的平均回收率分別為99.53％，99.08％，99.17％。各成分平均加樣回收率均大于95.0％，表明方法的準(zhǔn)確性良好。
　　
　　3、討論
　　
　　3.1　對照品的選擇，由于藥理學(xué)研究表明，皂苷類成份可能是蔥子防治心肌缺血的活性成分。同時，研究過程中發(fā)現(xiàn)，蔥子提取物的有效部位中主要含有包括上述四種皂苷在內(nèi)的十種皂苷類成份。在同樣的色譜條件下，藥材中含量較高的成分為上述三種皂苷。因此，選擇上述三種皂苷作為不同產(chǎn)地蔥子藥材含量的測定指標(biāo)。
　　3.2　色譜條件的選擇分別考察了甲醇一水系統(tǒng)流動相，但比較乙腈－水系統(tǒng)，其分離度較差，故選擇乙腈－水系統(tǒng)作為流動相。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，降低流動相的pH有利于改善峰形，同時對色譜峰的分離度影響較小。當(dāng)pH值在3左右時，其峰形較好，分離度穩(wěn)定，所以最終確定流動相為乙腈一水(甲酸調(diào)節(jié)pH3.3)。實驗中考察了25℃，30℃，35℃三種柱溫，結(jié)果表明：溫度為30℃時，三種成份的分離度較好。實驗中嘗試調(diào)節(jié)漂移管溫度，載氣壓力的參數(shù)，但發(fā)現(xiàn)對色譜峰峰形，分離度改善不明顯。因此選擇了通用參數(shù)：漂移管溫度40℃；載氣壓力3.5Bar作為ELSD的工作參數(shù)。
　　3.3　前處理條件的考察　由于含量測定考察的指標(biāo)同為皂苷類成份，溶出特點相似。因此在前處理條件的考察，同時兼顧了四類成份的含量。選擇了熱回流，索氏提取和超聲提取三種較常用的方法進(jìn)行試驗。結(jié)果表明，回流提取2h，索氏提取1h，超聲提取1h后，蔥子皂苷A，蔥子皂苷B，蔥子皂苷c的含量基本達(dá)到穩(wěn)定，在增加提取時間含量增加沒有明顯差別。三種提取方法最終提取得到的有效成分蔥子皂苷A，蔥子皂苷B，蔥子皂苷c的量沒有明顯差異，考慮到可能存在熱不穩(wěn)定性物質(zhì)和出于操作簡單的因素，決定采用超聲提取作為蔥子質(zhì)控的提取方法。
　　
　　參考文獻(xiàn)
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