白芍藥材薄層色譜鑒別和高效液相色譜特征圖譜研究

　　摘要：目的 研究白芍的薄層色譜和高效液相色譜指紋圖譜，為科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制其質(zhì)量提供可靠方法。方法 采用薄層色譜法檢測(cè)白芍樣品中的芍藥苷，展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）。采用高效液相色譜法，梯度洗脫，測(cè)定10批白芍樣品。色譜條件為：Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm， 12 nm），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05%磷酸水。結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰。10批白芍樣品獲得包括芍藥苷（9號(hào)峰）在內(nèi)的15個(gè)共有峰，其中安徽、浙江的白芍飲片指紋圖譜相互之間差異較小。結(jié)論 白芍的指紋圖譜特征性及專屬性強(qiáng)，可用于白芍飲片的質(zhì)量控制。
　　關(guān)鍵詞：白芍；薄層色譜法；高效液相色譜法；指紋圖譜
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.11.029
　　中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2014）11-0095-03
　　白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根[1]，主要含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酰羥基、芍藥苷等單萜類和苯甲酸、兒茶素、沒食子酸等成分[2]，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗肝損傷等作用[3]。本試驗(yàn)收集10批白芍樣品，分別采用薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC），對(duì)白芍的特征圖譜進(jìn)行系統(tǒng)研究，為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制白芍藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。
　　1 儀器與試藥
　　日本島津公司Shimadzu LC-20AB高液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器Prominence SIL-20A、二極管陣列檢測(cè)器SPD-M20A和柱溫箱CTO-20A；KQ3200DB型數(shù)控超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平，BS2242S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琪；硅膠預(yù)測(cè)薄層板，青島海洋化工廠；色譜柱為YMC-Pack ODS-A （250 mm×4.6 mm，5 μm）。甲醇，分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜級(jí)，美國(guó)天地；自制去離子水。
　　10批白芍樣品于夏、秋二季采挖，洗凈，除去頭尾和細(xì)根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，曬干，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，產(chǎn)地見表1。
　　2 薄層色譜鑒別
　　取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。取白芍樣品，經(jīng)60 ℃干燥，過夜，粉碎，過4號(hào)篩。取樣品粉末0.5 g，置于錐形瓶中，加80%甲醇10 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)�加乙�? mL使溶解，作為供試品溶液。吸取上述2種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。斑點(diǎn)清晰，分離效果好，結(jié)果易于分辨。
　　3 高效液相色譜指紋圖譜研究
　　3.1 色譜條件
　　色譜柱：Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 ?m，12 nm）；流動(dòng)相：乙腈（B）-0.1磷酸水溶液（A）；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 ?L；梯度洗脫程序見表2。
　　3.2 供試品溶液的制備
　　稱取上述10批白芍樣品粉末各2 g，置于500 mL錐形瓶中，加80%甲醇20 mL，水浴回流提取1 h，過濾，殘?jiān)�繼續(xù)加20 mL甲醇，回流提取，合并濾液，回收溶劑。用80%甲醇溶解殘留物，容量瓶定容至10 mL， 0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。
　　3.3 共有峰的標(biāo)定
　　采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》軟件自動(dòng)匹配10批白芍藥材的HPLC圖色譜峰保留時(shí)間和峰面積等參數(shù)，以平均數(shù)法作為對(duì)照指紋圖譜的生成方法，提取白芍藥材的共有模式，建立對(duì)照指紋圖譜。10批白芍藥材的色譜疊加圖見圖1。經(jīng)色譜分析，確立了15個(gè)共有峰，見圖2。根據(jù)指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果得出各樣品的相似度，10批樣品來自安徽和浙江2個(gè)產(chǎn)地，因此存在一定的差異，但其相似度仍達(dá)到0.8以上，具有很好的相關(guān)性，相似度計(jì)算數(shù)據(jù)見表3。
　　3.4 精密度試驗(yàn)
　　取同一供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，于高效液相色譜儀上連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖及峰面積積分值，將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》處理，得到各次進(jìn)樣的相似度，經(jīng)分析，結(jié)果峰面積積分值RSD=0.25%，符合特征圖譜的相關(guān)技術(shù)要求。以3號(hào)峰為參照，對(duì)各圖譜共有模式中已標(biāo)定的15個(gè)共有峰進(jìn)行計(jì)算，各圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值分別在0.00%～0.27%和0.14%～3.58%之間，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均無明顯變化，表明儀器等整個(gè)系統(tǒng)的精密度良好。
　　3.5 重復(fù)性試驗(yàn)
　　取1號(hào)白芍樣品共6份，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積積分值，將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》處理，得到各次進(jìn)樣的相似度，經(jīng)分析，結(jié)果峰面積積分值RSD=0.28%，符合特征圖譜的相關(guān)技術(shù)要求。以3號(hào)峰為參照，對(duì)各圖譜共有模式中已標(biāo)定的15個(gè)共有峰進(jìn)行計(jì)算，各圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值分別在0.00%～1.06%和0.29%～3.52%之間，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均無明顯變化，表明該分析方法的重復(fù)性良好。

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