以核基因ITS2片段為DNA條形碼鑒定中藥材威靈仙的研究分析

　　【摘要】 目的：探討以核基因ITS2片段為DNA條形碼鑒定中藥材威靈仙的效果，從而為臨床用藥提供依據(jù)。方法：選取18份威靈仙藥材樣品以及混偽品作為研究對象，提取威靈仙的DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增其ITS2序列，雙向測序，所得的序列經(jīng)過CodonCode Aligner進(jìn)行拼接，采用HMMer注釋法對網(wǎng)上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并構(gòu)建NJ（鄰接）樹。結(jié)果：威靈仙藥材的三個基源植物為毛茛科威靈仙、東北鐵線蓮、棉團(tuán)鐵線蓮，其序列長度分別為230 bp、230 bp、220 bp；威靈仙藥材正品來源的三種植物聚集為一枝，其支持率為83%；威靈仙與混偽品在二級結(jié)構(gòu)上具有明顯的差異。結(jié)論：核基因ITS2片段作為DNA條形碼能夠穩(wěn)定以及準(zhǔn)確的鑒別中藥材威靈仙以及混偽藥品，從而為保障臨床安全用藥提供一種新的技術(shù)手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　【關(guān)鍵詞】 ITS2片段； DNA條形碼； 中藥材； 威靈仙
　　中圖分類號 R28 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2014）8-0155-02
　　威靈仙屬于藥用植物，藥材基源以及來源比較多，在我國內(nèi)分布較廣泛，其根莖入藥具有通經(jīng)絡(luò)、風(fēng)濕以及消骨哽的功效，在膽結(jié)石、足跟痛以及食管癌等治療上起著重要作用[1]。作為常用中藥，地區(qū)用藥習(xí)慣的差異性較大，導(dǎo)致威靈仙使用混亂現(xiàn)象比較嚴(yán)重，因此有必要對威靈仙以及混偽品進(jìn)行鑒別研究。近年來，DNA條形碼技術(shù)因其具有較強(qiáng)的通用性以及鑒定結(jié)果可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定中。本文就運(yùn)用核基因ITS2片段來鑒定中藥材威靈仙以及混偽品，從而為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。
　　1 資料與方法
　　1.1 一般資料
　　本文選取的18份威靈仙樣品均來自Genbank下載序列，主要有棉團(tuán)鐵線蓮、東北鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、須蕊鐵線蓮、柱果鐵線蓮、草珊瑚、桃兒七、芍藥以及土茯苓。此樣品均經(jīng)過余霖副研究員鑒定，同時此標(biāo)本均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館得以保存。
　　1.2 鑒定方法
　　1.2.1 DNA提取 植物DNA提取試劑盒則來自北京天根生物技術(shù)有限公司；2×Tag PCR Master Mix采用北京艾德生物科技公司。采用70%的乙醇擦洗藥材樣品表面，擦洗完成之后進(jìn)行研磨；進(jìn)而取出16 mg的樣品；采用硅膠對植物葉進(jìn)行干燥，取30 mg樣品；最后采用提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取。
　　1.2.2 PCR擴(kuò)增以及側(cè)序 引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增引物正向?yàn)?’-GCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向?yàn)?’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40轉(zhuǎn)；72 ℃10 min。PCR體系含有25 mm的MgCl2 2 μl，2.5 mm的dNTP 2 μl，PCR bufer 2.5 μl（10×）。引物為1.0 μl（2.5 μm），聚合酶為1.0 U，DNA總共為1 μl，反應(yīng)體積為25 μl。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化之后，采用ABI3730XL測序儀進(jìn)行雙向測序[2-3]。
　　1.3 數(shù)據(jù)處理分析
　　所有序列采用CodonCode Aligner V2.06校對拼接，去除引物區(qū)。對于網(wǎng)上所獲取的ITS序列，均采用HMMer注釋法進(jìn)行分析進(jìn)而獲得ITS2間隔序列。然后，將所有序列采用軟件MEGA5.0進(jìn)行分析對比。采用NJ鄰接法對利用對比過的序列構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，對各種物種進(jìn)行鑒定。最后，根據(jù)ITS2數(shù)據(jù)庫以及網(wǎng)站對ITS2的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。
　　2 結(jié)果
　　2.1 序列比較
　　威靈仙藥材的三個基源植物分別為毛茛科威靈仙（clematis chinensis osbeck）、東北鐵線蓮（clematis manshurica rup）、棉團(tuán)鐵線蓮（clematis hexapetala pall）。其序列長度分別為230 、230、220 bp。威靈仙與東北線鐵鏈、棉團(tuán)鐵線蓮之間的距離分別為0.017、0.006。由此看出，威靈仙與三個藥品源的遺傳距離最小，并且差異最小。草珊瑚與棉團(tuán)鐵鏈、東北線鐵線蓮之間的遺傳距離分別為1.077、1.146，得出其他藥品之間的遺傳距離相對較大。
　　2.2 聚類分析
　　通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，看出威靈仙不同來源樣品為一枝，呈現(xiàn)明顯的單系性，其支持率為83%。
　　2.3 威靈仙以及混偽品ITS2的序列二級結(jié)構(gòu)
　　威靈仙與三個混偽品在二級結(jié)構(gòu)上具有明顯的差異，主要表現(xiàn)在莖環(huán)（loop）的大小、樹木以及位置上，不同物種之間或多或少都存在一定的區(qū)別。
　　3 討論
　　威靈仙（radix clematidis）為雙葉子植物毛茛科植物威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮（山蓼）或者東北鐵線蓮（黑薇）的干燥根以及根莖[4]。具有通經(jīng)止痛的效果，在臨床用藥中得到廣泛應(yīng)用。然而，由于地方用藥之間存在一定的差異，使得威靈仙用藥混亂現(xiàn)象較為嚴(yán)重。如南方則以毛茛科鐵線蓮屬Clematis植物作為威靈仙的入藥，北方則以百合科菝葜屬Smildx植物作為威靈仙入藥。同時由于沒有專業(yè)以及統(tǒng)一的鑒定人員對威靈仙藥材進(jìn)行鑒定，使得使用者使用該藥物之后，中毒現(xiàn)象時常發(fā)生，對人體身體健康帶來嚴(yán)重影響[5]。鑒于此種情況，需要一種簡單并且迅速的方法來對威靈仙藥材以及偽劣品進(jìn)行鑒別。
　　傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法如化學(xué)指紋圖譜等鑒定方法、顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)、以及超微結(jié)構(gòu)方法等，在中藥材鑒定以及評價(jià)質(zhì)量上起著重要作用[6]。然而，由于中藥飲片、中藥粉末以及含有生藥原型的傳統(tǒng)中成藥的鑒定較為困難，這些方法已經(jīng)不能精確對其地進(jìn)行鑒定。準(zhǔn)確的物種鑒定是人類認(rèn)知生物多樣性的前提條件，在此種環(huán)境下，DNA條形碼應(yīng)運(yùn)而生。DNA條形碼主要是利用基因組中相對較短的DNA片段進(jìn)行藥材物種進(jìn)行鑒別的手段。通過此種方法能建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫以及鑒定平臺，實(shí)現(xiàn)藥材正品與偽劣品的鑒別。另一方面，ITS2序列的長度較短，容易擴(kuò)增，同時作為ITS的一部分，在系統(tǒng)化研究中得到廣泛應(yīng)用，同時也是藥用植物DNA條形碼鑒定中最優(yōu)的序列。國內(nèi)外已經(jīng)有學(xué)者對其序列組合進(jìn)行研究[7-9]，同時提出了不同的序列組合來作為植物鑒定的條形碼。據(jù)文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道，其鑒定物種水平的能力達(dá)到93.1%，優(yōu)于國際條形碼協(xié)會提出的組合標(biāo)準(zhǔn)。在本次研究中，通過ITS2片段能夠鑒定出威靈仙與混劣品之間的差異。

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