炙甘草藥材指紋圖譜研究

　　[摘要] 采用Agilent TC-C₁₈（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），以乙腈-水（含0.2%甲酸）為流動相梯度洗脫建立了炙甘草藥材的HPLC指紋圖譜，并采用HPLC-MS/MS對19個(gè)共有峰中的6個(gè)色譜峰進(jìn)行了定性鑒別。采用該方法測定了10批不同產(chǎn)地的炙甘草藥材，其相似度在0.72～0.99。該方法精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，該研究為炙甘草藥材的質(zhì)量控制提供了參考。
　　[關(guān)鍵詞] 炙甘草； HPLC； 指紋圖譜； 質(zhì)量控制
　　[收稿日期] 2014-02-11
　　[基金項(xiàng)目] 國家 “重大新藥創(chuàng)制” 科技重大專項(xiàng) （2011ZX09201-201-13，2012ZX09301003-001-004，2013ZX09508-105）
　　[通信作者] 喬善義，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞旨百|(zhì)量控制，Tel：（010）66930634，E-mail：crbj611202@sina.com
　　[作者簡介] 孫磊，實(shí)驗(yàn)師，Tel：（010）66930634， E-mail：rubyslsl@126.com
　　甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖除去雜質(zhì)、洗凈、潤透并干燥的炮制品，炙甘草是生甘草按照蜜炙法炒至黃色至深黃色的炮制品[1]。甘草素有“十方九草”之謂，具有清熱解毒，補(bǔ)氣益脾胃，潤肺祛痰，緩急止痛，調(diào)和諸藥的作用[2]，而炙甘草雖基原與甘草相同，但經(jīng)炮制后，其性味功效也有區(qū)別，炙甘草具有補(bǔ)脾和胃、益氣復(fù)脈的功效，與生品相比增強(qiáng)了補(bǔ)脾益氣的作用[3]。
　　中藥化學(xué)成分指紋圖譜是指中藥材或中成藥經(jīng)適當(dāng)?shù)那疤幚砗�，采用一定的分析手段得到的能夠�?biāo)志該中藥材或中成藥特征的色譜圖或光譜圖。現(xiàn)行炙甘草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅測定甘草苷和甘草酸這2個(gè)指標(biāo)成分的含量，往往不能全面的反應(yīng)炙甘草的質(zhì)量，指紋圖譜技術(shù)從中藥藥效來自多種化學(xué)物質(zhì)綜合作用的觀點(diǎn)出發(fā)，與測定單一組分相比，能夠提供更豐富、有效的質(zhì)量信息，因此指紋圖譜技術(shù)可以更客觀、科學(xué)、合理地進(jìn)行中藥質(zhì)量控制。本課題組對中藥經(jīng)典方劑小柴胡湯的指紋圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)研究[4-5]，炙甘草是小柴胡湯方劑的重要組成部分，對各單味藥材的HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究是實(shí)現(xiàn)對中藥方劑全面質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。對于炙甘草藥材的指紋圖譜研究，已有部分文獻(xiàn)進(jìn)行了報(bào)道[3，6]，但對于炙甘草指紋圖譜中共有峰的定性鑒別，尚未見相關(guān)報(bào)道，本文采用HPLC，建立了炙甘草藥材的高效液相色譜指紋圖譜，同時(shí)采用HPLC-MS/MS方法對部分色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)，為炙甘草指紋圖譜中的成分確認(rèn)及其質(zhì)量控制提供了參考。
　　1 材料
　　日立L-2000高效液相色譜儀；Agilent 6330離子阱質(zhì)譜儀，配有Agilent 1100液相色譜儀；北京長風(fēng)HW·SY-K4型智能電熱恒溫水浴鍋；KQ2200E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；東京理化N-1001D-WA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Sartorius-BS 124S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；安徽科大中佳SC-3614型離心機(jī)。
　　水為娃哈哈純凈水；乙腈和甲醇均為色譜純；其余試劑為分析純。10批不同來源炙甘草見表1。
　　2 方法與結(jié)果
　　2.1 對照品溶液制備
　　稱取上述G1～G10號炙甘草樣品各10 g，加入10 倍量蒸餾水回流提取2 次，每次2 h，過濾，合并2次濾液。將濾液濃縮至1 mL藥液相當(dāng)于6 g生藥，加入適量無水乙醇，至溶液中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%，均勻攪拌，靜置過夜，離心（25 min，2 500 r·min^-1），用70%乙醇洗滌沉淀，離心（25 min，2 500 r·min^-1），合并上清，濃縮除去乙醇，將得到的提取物70 ℃真空干燥，得到炙甘草樣品。精密稱取上述樣品0.030 0 g，用50%色譜純甲醇定容至10 mL量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，得到炙甘草供試品溶液，進(jìn)行HPLC分析。
　　2.2 色譜條件
　　色譜柱為Agilent TC-C₁₈（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；以乙腈（A）-水（B，含0.2%甲酸）為流動相，梯度洗脫，見表2；流速1.0 mL·min^-1；檢測波長265 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL。
　　2.3 質(zhì)譜條件
　　離子源為ESI源，負(fù)離子掃描模式，霧化氣壓力為2.7×10⁵ Pa，干燥氣流量為10.0 L·min^-1，離子源溫度為350 ℃，碎裂電壓1。梯度洗脫程序同2.2。
　　2.4 指紋圖譜的建立與共有指紋峰的指認(rèn)
　　2.4.1 指紋圖譜的建立 取2.1項(xiàng)制備的供試品溶液各20 μL，按照2.2項(xiàng)所述條件下進(jìn)行測定，得到10批不同來源炙甘草HPLC指紋圖譜，根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對保留時(shí)間，確定共有峰，并選取其中19個(gè)特征色譜峰，建立的HPLC共有模式圖見圖1。
　　2.4.2 共有指紋峰的指認(rèn) 為進(jìn)一步闡明炙甘草的化學(xué)組成，采用HPLC-MS/MS技術(shù)并結(jié)合文獻(xiàn)，對HPLC指紋圖譜19個(gè)特征色譜峰中的6個(gè)色譜峰進(jìn)行了推測，見表3。
　　2.5 方法學(xué)考察
　　2.5.1 精密度試驗(yàn) 取2.1項(xiàng)下同一供試品溶液按2.2項(xiàng)下所述條件連續(xù)測定6次，考察各共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到相對保留時(shí)間的RSD<0.50%，相對峰面積RSD<10%，表明儀器穩(wěn)定，精密度良好。
　　2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.1項(xiàng)下同一供試品溶液按2.2項(xiàng)下所述條件，分別在0，2，4，6，12，24 h測定其指紋圖譜，考察各共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到相對保留時(shí)間的RSD<0.70%，相對峰面積RSD<10%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

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