天冬藥材基因組DNA提取方法研究

　　摘要 [目的]從天冬藥材中提取可用于RAPD擴增的高質(zhì)量基因組DNA。[方法]分別采用改良CTAB法、SDS法以及植物基因組DNA提取試劑盒法提取天冬藥材基因組DNA；通過電泳、DNA濃度與純度檢測以及RAPD擴增效果確定天冬藥材基因組DNA的最佳提取方法。[結(jié)果]CTAB法提取的基因組DNA較完整，DNA濃度與純度均較高，可獲得豐富的、清晰的RAPD條帶。[結(jié)論]CTAB法為天冬藥材基因組DNA提取的最佳方法，提取的DNA可用于天冬RAPD分析，該方法可為其他藥材基因組DNA提取提供參考。
　　關(guān)鍵詞 天冬；藥材；基因組DNA提��；RAPD
　　中圖分類號 S567.23 文獻標識碼 A
　　文章編號 0517-6611（2019）08-0171-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.045
　　Abstract [Objective]The research aimed to extract highquality genomic DNA which was used for RAPD amplification from herbal pieces such as ASPARAGI RADIX. [Method]Different methods， CTAB method， SDS method and DNA secure Plant Kit method were used to genomic DNA extract from ASPARAGI RADIX.The DNA samples obtained by the above methods were tested by agarose gel electrophoresis， concentration and purity of DNA and RAPD amplification. [Result]The more profuse and clear RAPD bands were obtained with random primers S7 by using improved CTAB. [Conclusion]CTAB method and RAPD reaction system can be used to RAPD analysis in ASPARAGI RADIX，which can provide certain reference for the extraction of genomic DNA of Chinese traditional medicine.
　　Key words ASPARAGI RADIX；Medicinal materials；Extraction of genomic DNA；RAPD
　　天冬（ASPARAGI RADIX）為百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.的干燥塊根，主要含有多糖、皂苷等成分[1-3]，具有養(yǎng)陰潤燥、清肺生津等功效，用于肺燥干咳、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘、熱病津傷等[4]，為烏雞白鳳丸、二冬膏、黨參固本丸、冬白梅片、咽炎片等著名制劑的主要原料藥材。天冬在我國分布較廣泛，其主產(chǎn)于廣西、貴州、云南等地，并以貴州產(chǎn)的天冬質(zhì)量最好[5]。
　　近年來，DNA分子標記鑒定技術(shù)相對于傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別而言，具有遺傳穩(wěn)定性、遺傳多樣性、化學(xué)穩(wěn)定性等特點，被廣泛用于中藥基源鑒定、道地性研究、植物分類中，而快速、有效地提取高質(zhì)量的基因組DNA成為中藥材分子鑒定的關(guān)鍵。由于大多數(shù)中藥資源分布較為廣泛，其DNA分析標記鑒定研究材料多采用新鮮幼嫩葉片，不同分布地域新鮮幼嫩葉片采集較困難。而商品中藥材多為干品，其在加工、貯藏過程中，如日曬、高溫烘干等會造成DNA的降解；其次，中藥材不同藥用部位中的多糖、脂質(zhì)、色素、酚類和其他次生代謝產(chǎn)物會影響基因組DNA的提取[6]。因此，該研究以市售商品藥材天冬為樣品進行DNA提取方法研究，以期獲得高質(zhì)量的商品天冬基因組DNA，為中藥材分子標記技術(shù)研究提供參考依據(jù)，也為后期基于DNA分子標記鑒定技術(shù)的天冬藥材質(zhì)量與遺傳多樣性的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。
　　1 材料與方法
　　1.1 試材 天冬藥材購于貴陽市花果園藥材市場和貴陽市萬東橋藥材市場，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)覃容貴教授鑒定為百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.的干燥塊根，標本存放于貴州醫(yī)科大學(xué)中藥材質(zhì)量研究室。
　　1.2 試劑 DP-320新型植物基因組DNA提取試劑盒（北京TIANGEN生化科技有限公司）；DNA Marker DL2000；2×Taq PCR MasterMix；GoldView Ⅰ 核酸染色劑；CTAB；SDS；β-巰基乙醇；50×TAE緩沖液；平衡酚；氯仿；異戊醇；醋酸鈉；TGL-16G臺式高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DYY-12C電泳儀（北京市六一儀器廠）；L96G型PCR擴增儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國）；電子分析天平（型號A-L-204，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（型號DK-98-Ⅱ）；XH-B型漩渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；無水乙醇等均為分析純，水為蒸餾水。
　　1.3 方法
　　1.3.1 天冬基因組DNA的提取。
　　1.3.1.1 改良 CTAB 法[7-8]提取天冬藥材DNA。稱取天冬粉末100 mg置于研缽中，加入液氮研磨成細粉，將細粉轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，加入600 μL 65 ℃預(yù)熱的2%CTAB提取液和2 μL β-巰基乙醇，混勻。再加入6 μL RNA酶，上下顛倒混勻，于65 ℃水浴1 h，期間每20 min顛倒混勻1次。取出冷卻至室溫，12 000 r/min離心10 min，取上清液置新的離心管中，加入等體積的酚∶三氯甲烷∶異戊醇（25∶24∶1），混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等體積的三氯甲烷∶異戊醇（24∶1），離心10 min，取上清液，再次加入等體積的三氯甲烷∶異戊醇（24∶1），離心10 min。將上清液加入到EP管中，并加入1/3體積的NaAC溶液和1 mL -20 ℃預(yù)冷的無水乙醇，于-20 ℃放置3 h，取出12 000 r/min離心15 min，棄上清液，用75%乙醇洗滌2次，晾干乙醇，加入50 μL TE溶劑溶解DNA，置于-20 ℃保存，備用。

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