HPLC測定馬甲子藥材中馬甲子1#的含量

　　摘要：建立HPLC測定馬甲子1#含量的方法，采用BDS HYPERSIL C18色譜柱（4.6mmxlOOmmx2.4μm），以乙腈-O.1%甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速為1.OmL/min，檢測波長為320nm。結果表明馬甲子1#在0.0214-0.8544μg（r=0.9999）范圍進樣量與峰面積線性關系良好，平均加樣回收率為99.4%（RSD=1.18%）。該方法快速，準確，重現(xiàn)性好，可用于測定馬甲子中馬甲子1#的含量。
　　關鍵詞：馬甲子；馬甲子l#；高效液相色譜法（HPLC）；含量測定
　　文獻標志碼：A
　　文章編號：1674-5124（2015）04-0043-03
　　0 引言
　　馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir系鼠李科銅錢屬植物，又名鐵籬笆、銅錢樹。其根部具有發(fā)表解熱，祛風利濕，治跌打損傷及心腹疼痛的功能，其葉具有治癰瘡潰瘍作用。經(jīng)本課題組的前期研究證實其葉也具有抗腫瘤作用且療效較好。為了探索馬甲子葉中的相關活性成分，本文對馬甲子葉中的某些戍分進行了提取分離、結構鑒定和抗腫瘤等方面的研究，得到了新的活性單體馬甲子l#，為了進一步研究該成分，制定了本文的含量測定方法。
　　1 實驗部分
　　1.1 儀器與試藥
　　1200高效液相色譜儀（美國安捷倫）；SartoriusBS2IOS電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。
　　乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；水（樂百氏純凈水）；甲酸、甲醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。
　　藥材：于2013年6月采自四川省牧馬山的鮮葉，經(jīng)鑒定為鼠李科銅錢屬植物馬甲子Paliurus ramo-sissimus（Lour.）Poir.，冷凍干燥備用；馬甲子l#對照品（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：14070109），純度經(jīng)歸一化法測定為97.4%。馬甲子1#經(jīng)結構鑒定，未見相關文獻報道，屬于新化合物，結構式見圖l。
　　1.2 方法與結果
　　1.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗
　　色譜柱為BDS HYPERSIL C18色譜柱（4.6mmX100 mmx2.4μm，Thermo Fisher Scientific）；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，按表l進行梯度洗脫；檢測波長為320nm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為10μL。理論塔板數(shù)按馬甲子1#計算應不低于3000。分別選擇乙腈-水，乙腈-0.1%冰醋酸溶液，乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相，考察不同流動相系統(tǒng)對樣品的分離效果。結果表明，采用乙腈-0.1%甲酸溶液系統(tǒng)時主峰與雜質峰分離較好，且分離度>1.5，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液系統(tǒng)。在小范圍內改變進樣體積、柱溫及流速，色譜圖無明顯變化。對照品和供試品溶液的色譜圖分別見圖2（a）和圖2（b）。
　　1.2.2 樣品的制備
　　精密稱取馬甲子1#對照品適量，用甲醇制成含馬甲子1#0.1068mg/mL的對照品貯備液。分析測試中所用對照品溶液由對照品貯備液稀釋得到。
　　取馬甲子藥材粉末（過4號篩）約2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇50mL，稱定質量，回流提取2h后，取出，冷卻，再稱定質量，用95%乙醇補足損失的質量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。
　　1.2.3 線性范圍考察
　　分別精密移取馬甲子l#對照品貯備液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，8.0mL置于lOmL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“1.2.1”項下的色譜條件測定馬甲子1#的峰面積，并以進樣量對其峰面積進行線性回歸，得到回歸方程為：Y_馬甲子1#=2.396x10³X-4.758（r=0.9999）。結果表明馬甲子1#在0.0214-0.8544μg范圍進樣量與峰面積線性關系良好。結果見圖3。
　　1.2.4 精密度試驗
　　取含馬甲子1#0.02136mg/mL的對照品溶液，重復進樣5次，計算馬甲子1#峰面積的RSD為0.73%，結果表明進樣精密度良好。
　　1.2.5 重復性試驗
　　取同一批號的馬甲子藥材粉末（過4號篩）6份，按“1.2.2”項方法制備供試品溶液，測定，計算馬甲子1#含量的RSD為0.70%，結果表明方法重復性良好。
　　1.2.6 穩(wěn)定性試驗
　　取同一對照品溶液，于室溫下0，2，4，6，8，12，24h分別進行測定，以峰面積為指標計算馬甲子1#的RSD為1.05%，結果表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。
　　1.2.7 加樣回收率試驗
　　稱取已測定含量的馬甲子藥材粉末（過4號篩）約2.5 9，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共6份，分別精密加入對照品貯備液SmL，精密加入95%乙醇50mL，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定，結果表明回收率較好（見表2）。
　　1.2.8 樣品測定
　　在本文色譜條件下，被測成分與其他化合物色譜峰分離度均良好。對10批馬甲子藥材進行測定，結果見表3。
　　2 討論
　　馬甲子藥材中馬甲子l#含量的測定試驗，通過前期單因素試驗考察了馬甲子1#的提取工藝，并從操作便捷性和節(jié)約資源等方面綜合考慮最終確定了供試品溶液的制備方法。用本文色譜條件測定10批馬甲子藥材中馬甲子1#的含量，其中批號140523的藥材中馬甲子1#含量最高，同時該批次馬甲子藥材抗腫瘤活性最強，由此進一步確定其為馬甲子藥材抗腫瘤活性成分之一。馬甲子l#含量的測定能夠初步評價不同產(chǎn)地、不同采收期馬甲子藥材的質量，為民間癌癥患者用藥提供了一定的參考。
　　3 結束語
　　目前對馬甲子的研究主要集中在其根、莖、果實中化學成分的分離鑒定，而馬甲子葉中化學成分的研究未見報道。馬甲子l#屬于從馬甲子葉中分離得到具有門樺酸母核的新的五環(huán)三萜類化合物，具有一定的抗腫瘤活性，有較好的研究前景。本文所建立的HPLC法能有效地將馬甲子藥材中馬甲子l#與其他成分分開，分離度>1.5，且峰形較好，分析時間短，為馬甲子1#定量分析提供了參考，為后期的深入研究奠定了一定的基礎。

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