課題1,微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

　專題 2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

　在繽彩紛呈的生物世界，微生物似乎顯得過于微小與沉寂。然而，它們?cè)谧匀唤鐓s作用非凡！

　生物學(xué)發(fā)展的歷史表明，諸多革命性地改變?nèi)祟悓?duì)生命的認(rèn)識(shí)的事件，都與微生物有著千絲萬縷的聯(lián)系。例如，自然發(fā)生說的破滅，酶的原始概念“酵素”的提出，肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明 DNA是遺傳物質(zhì)，青霉素的發(fā)現(xiàn)，第一個(gè)雜合 DNA分子的體外構(gòu)建„„ 在借助顯微鏡第一次直面微生物之后，一代又一代科學(xué)家建立、發(fā)展和完善了微生物技術(shù)。課題 1將帶領(lǐng)我們學(xué)習(xí)這些技術(shù)中最基本、最核心的微生物培養(yǎng)技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，我們不妨也嘗試一下本專題中的其他課題。相信在逐步深入的探索中，你能充分體會(huì)到動(dòng)手動(dòng)腦做科學(xué)的樂趣。

　課題 1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 課題背景 19 世紀(jì)中期，關(guān)系到法國經(jīng)濟(jì)命脈的釀造業(yè)曾一度遭受殷滅性的打擊。在生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)了葡萄酒變酸、變味的怪事。經(jīng)過一番研究，法國科學(xué)家巴斯德發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致生產(chǎn)失敗的根源在于發(fā)酵物中混入了雜菌。由此人們認(rèn)識(shí)到保持培養(yǎng)物純凈的重要性。

　防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物，是研究和應(yīng)用微生物的前提。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物，一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，另一方面需要確保無處不在的其他微生物無法混入。在本課題中，我們將通過培養(yǎng)大腸桿菌（ Escherichia coil ）的實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)的基本技術(shù)。

　基礎(chǔ)知識(shí) （一）培養(yǎng)基 人們按照微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)——培養(yǎng)基（culture media）。其中，配制成的液體狀態(tài)的基質(zhì)稱為液體培養(yǎng)基，配制成的固體狀態(tài)的基質(zhì)稱為固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基，它是實(shí)驗(yàn)室中最常用的培養(yǎng)基之一。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落（圖 2-1）。

　 雖然各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物質(zhì)）、氮源（提供氮元素的物質(zhì)）和無機(jī)鹽�；貞浻嘘P(guān)活細(xì)胞中元素組成的知識(shí)，想一想為什么大多數(shù)培養(yǎng)基都含有這四類物質(zhì)。下面讓我們一起來看一看某種細(xì)菌培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成。

　在提供上述幾種主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對(duì) pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時(shí)需將培養(yǎng)基的 pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)需將 pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)則需要提供無氧的條件。

　? 瓊脂（agar）是一種從紅藻中提取的多糖。瓊脂在 98℃以上熔化，在 44℃以下凝固，在常規(guī)培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)固態(tài)。

　? 牛肉膏和蛋白胨來源于動(dòng)物原料，含有糖、維生素和有機(jī)氮等營養(yǎng)物質(zhì)。

　? 你想知道固體培養(yǎng)基的來歷嗎？請(qǐng)點(diǎn)擊人教網(wǎng) www.pep.com.cn 查詢。

�。ǘ�）無菌技術(shù) 獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵。無菌技術(shù)圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括以下幾個(gè)方面。

　1.對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒（disinfection）

　。

　2.將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌（sterilization）。

　3.為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。

　4.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

　無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？ ? 消毒是指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。下面，我們重點(diǎn)學(xué)習(xí)消毒和滅菌的方法。

　實(shí)驗(yàn)室常用的消毒和滅菌方法 在實(shí)驗(yàn)室中，切不可吃東西、喝水，離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。

　消毒方法 日常生活中經(jīng)常用到煮沸消毒法。在 100℃煮沸 5~6min 可以殺死微生物細(xì)胞和一部分芽孢。對(duì)于一些不耐高溫的液體，如牛奶，則使用巴氏消毒法，在 70~75℃煮 30min 或在 80℃煮 15 min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞。此外，人們也常使用化學(xué)藥劑進(jìn)行消毒，如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。

　灼燒滅菌 將微生物的接種工具，如接種環(huán)、接種針或其他金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，可以迅速徹底地滅菌（圖 2-2）。此外，在接種過程中，試管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通過火焰灼燒來滅菌。

　干熱滅菌

　將滅菌物品放入干熱滅菌箱（圖 2-3）內(nèi)，在 160~170℃加熱 1~2 h 可達(dá)到滅菌的目的。能耐高溫的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培養(yǎng)皿）和金屬用具等，可以采用這種方法滅菌。干熱滅菌的具體操作步驟參見附錄 4。

　高壓蒸汽滅菌

　將滅菌物品放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋（圖 2-4 ）內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，將其中原有的冷空氣徹底排除后，將鍋密閉，繼續(xù)加熱使鍋內(nèi)的氣壓逐步上升，溫度也隨之升到 l00℃以上。為達(dá)到良好的滅菌效果，一般在壓力為 100 kPa，溫度為 121℃的條件下，維持 15~30min。高壓蒸汽滅菌的具體操作步驟參見附錄 4。

　除了以上方法外，實(shí)驗(yàn)室里還用紫外線或化學(xué)藥物進(jìn)行消毒。例如，接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)在使用前，可以用紫外線照射 30 min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。在照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強(qiáng)消毒效果。實(shí)驗(yàn)室中常用的其他化學(xué)消毒劑，參見附錄 5。

　清你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。

　1.培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿。

　2.玻棒、試管、燒瓶和吸管。

　3.實(shí)驗(yàn)操作者的雙手。

　實(shí)驗(yàn)操作 ? 教學(xué)用的大楊桿菌可以到國家指定的菌種保藏中心購買。

　本實(shí)驗(yàn)用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌的純化培養(yǎng)，可分成制備培養(yǎng)基和純化大腸桿菌兩個(gè)階段進(jìn)行。

�。ㄒ唬┲苽渑Ｈ飧嗟鞍纂斯腆w培養(yǎng)基 1. 計(jì)算

　根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例，計(jì)算配制 100mL 的培養(yǎng)基時(shí)，各種成分的用量。

　? 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方 牛肉膏

　 5.0g 蛋白胨

　 10.0g NaCl

　5 .0g 瓊脂

　20 .0g 將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至 1 000 mL。

　2. 稱量

　準(zhǔn)確地稱取各種成分。牛肉膏比較粘稠，可以用玻棒挑取，放在稱量紙上稱量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速，稱后要及時(shí)蓋上瓶蓋。

　3. 溶化

　將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯，加入少量的水，加熱。當(dāng)牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻棒取出稱量紙。往燒杯中加入稱量好的蛋白胨和氯化鈉，用玻棒攪拌，使其溶解。加入瓊脂，加熱使其熔化。在此過程中，不斷用玻棒攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。當(dāng)瓊脂完全熔化后，補(bǔ)加蒸餾水至 100mL 。

　4. 滅菌

　將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓滅菌鍋，在壓力為 100kPa、溫度為 121℃條件下，滅菌 15~30min。將培養(yǎng)皿用幾層舊報(bào)紙包緊，5~8套培養(yǎng)皿作一包，包好后放入干熱滅菌箱內(nèi)，在 160~170℃下滅菌 2 h。

　5. 倒平板

　待培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板的具體操作描述如下。

　倒平板操作 1.將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

　2.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。

　3.用左于將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約 10~20mL）倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

　4.等待平板冷卻凝固（大約需 5~10min）后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下、皿底在上。

　討論 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到 50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？ 2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ （二）純化大腸桿菌 微生物接種的方法很多，最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。請(qǐng)你選用其中的一種方法，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上純化大腸桿菌。

　? 微生物的接種技術(shù)還包括斜面接種、穿刺接種等方法。雖然這些技術(shù)的操作方法各不相同，但是，其核心都是要防止雜菌的污染，保證培養(yǎng)物的純度。

　平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體，這就是菌落（colony）。

　1.將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。

　2.在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開盛有菌液的試管的棉塞。

　3.將試管口通過火焰。

　4.將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，沾取一環(huán)菌液。

　5.將試管口通過火焰，并塞上棉塞。

　6.左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。

　7.灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。

　討論 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ 2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？ 3.在做第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落。

　系列稀釋操作

　1.將分別盛有 9mL水的 6 支試管滅菌，并按 10 1 ~10 6 的順序編號(hào)。

　2.用移液管吸取 1 mL 培養(yǎng)的菌液，注入 10 1 倍稀釋的試管中。用手指輕壓移液管上的橡皮頭，吹吸三次，使菌液與水充分混勻。

　3.從 10 1 倍稀釋的試管中吸取 1 mL 稀釋液，注入 10 2 倍稀釋的試管中，重復(fù)第 2 步的混勻操作。依次類推，直到完成最后一支試管的稀釋。

　注意：移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時(shí)，試管口和移液管應(yīng)在離火焰 1~2cm處。

　涂布平板操作

　l.將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。

　2.取少量菌液（不超過 0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。

　3.將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻 8~10s。

　4.用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液分布均勻。

　注意：1.將涂布器末端浸在盛有體積分?jǐn)?shù)為 70%的酒精的燒杯中。取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

　2.操作中一定要注意防火！不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。

　討論 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第 2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？ 將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基都放入 37℃恒溫箱中，培養(yǎng) 12h 和 24 h 后，分別觀察并記錄結(jié)果。

　結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？ 2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，你是否觀察到了獨(dú)立的菌落？這些菌落的顏色、形狀和大小相似嗎？ 3.培養(yǎng) 12 h和 24 h 后，觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同嗎？如果不同，請(qǐng)分析產(chǎn)生差異的原因。

　4.如果你在培養(yǎng)基上觀察到了不同形態(tài)的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎？ 5.你是如何記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果的？與其他同學(xué)交流互評(píng)。

　課題延伸 為了保持菌種的純凈，需要進(jìn)行菌種的保藏。對(duì)于頻繁使用的菌種，我們可以采用臨時(shí)保藏的方法。首先，將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長成后，將試管放入 4℃的冰箱中保藏（圖 2-5）。以后每 3~6 個(gè)月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。但是，這種方法保存的時(shí)間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。

　對(duì)于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。在 3mL 的甘油瓶中，裝人 1 mL 甘油后滅菌。將 1 mL 培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的冷凍箱中保存。

　練習(xí) 習(xí) 1.請(qǐng)你想一想，日常生活中保存食品的方法有哪些？這些方法是如何阻止或抑制微生物生長的？

　2.無土栽培技術(shù)是用人工配制成的培養(yǎng)液來栽培植物；植物組織培養(yǎng)技術(shù)則是將植物體的組織接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)；而在本課題中，我們著重學(xué)習(xí)了微生物的培養(yǎng)技術(shù)。請(qǐng)你比較這三種培養(yǎng)技術(shù)在設(shè)計(jì)思路和具體操作上的異同。

　3.巴斯德設(shè)計(jì)的鵝頸瓶實(shí)驗(yàn)有力地駁斥了“自然發(fā)生論”，證明微生物只能由微生物產(chǎn)生，不能從沒有生命的物質(zhì)自然產(chǎn)生。請(qǐng)你解釋其實(shí)驗(yàn)原理，并分析這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)于微生物學(xué)的進(jìn)步、微生物學(xué)的研究方法以及食品保存等方面所產(chǎn)生的影響。

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